乳腺癌易感基因BRCA1和BRCA2检测试剂盒及方法技术

本发明专利技术公开一种乳腺癌易感基因BRCA1和BRCA2检测试剂盒及方法；试剂盒包括：第一轮PCR试剂和第二轮PCR试剂；第一轮PCR试剂包括：缓冲溶液，镁盐，脱氧核糖核苷三磷酸，酶混合液，第一轮PCR引物；第二轮PCR试剂包括：缓冲溶液，镁盐，脱氧核糖核苷三磷酸，酶混合液，第二轮PCR引物；第一轮PCR引物包括46对引物SEQ1‑SEQ92和67对引物SEQ93‑SEQ226，每个上游引物的5’端添加序列SEQ227，每个下游引物的5’端添加序列SEQ228；本发明专利技术公开了的检测试剂盒及方法，引物组合共包含113对引物，覆盖了乳腺癌易感基因的全部编码序列及邻近至少±5bp内含子区域。本发明专利技术采用NGS技术对乳腺癌易感基因BRCA1和BRCA2基因全编码序列和剪切位点的突变进行检测，具有很高的特异性及准确性，且方法简便高效。

【技术实现步骤摘要】
乳腺癌易感基因BRCA1和BRCA2检测试剂盒及方法
本专利技术涉及生物检测
，特别涉及乳腺癌易感基因BRCA1和BRCA2检测试剂盒及方法。
技术介绍
乳腺癌、卵巢癌是威胁女性健康的最常见的恶性肿瘤。BRCA1和BRCA2是目前研究较为普遍与乳腺癌和卵巢癌发生有密切关联的两个易感基因，在DNA损伤修复、细胞周期调节、基因转录激活、染色质稳定等方面发挥着重要作用。研究表明，约2％-6％的女性乳腺癌患者和10％-15％的卵巢癌患者存在BRCA1和BRCA2基因突变。BRCA1和BRCA2这两个基因的突变状态与家族性乳腺癌、卵巢癌的发病关系十分密切。与无突变者/普通人群相比，携带BRCA1和BRCA2基因突变的个体发展成为乳腺癌和卵巢癌的患病风险和复发风险均显著增加。携带有BRCA1和BRCA2基因突变的女性在其一生中最高有87％的可能性发生乳腺癌，有87％的可能性发生乳腺癌。BRCA1和BRCA2有害突变还可能增加患胰腺癌，胃癌，胆囊和胆管细胞癌，黑色素瘤和前列腺癌等其它风险。因此，对乳腺癌/卵巢癌高风险人群进行BRCA1和BRCA2基因检测很有必要。据乳腺癌信息中心(BreastCancerInformationCore,BIC)报道：BRCA1、BRCA2的基因突变已达3000多种，这些突变分布于整个编码区。最常见的致病突变为移码突变、无义突变等，没有明显的突变热点。大多数突变导致截短蛋白的生成，使得BRCA1、BRCA2蛋白质正常功能的丧失，从而导致肿瘤发生。随着分子生物学的飞速发展，越来越多的分子生物学方法应用于检测乳腺癌易感基因BRCA1和BRCA2突变检测，主要包括Sanger测序、高分辨熔点曲线分析等。而随着新一代测序(NGS)技术的发展，其在BRCA1和BRCA2基因突变检测领域的应用已越来越广泛，也越来越为人所重视，乳腺癌易感基因BRCA1和BRCA2突变筛查中，NGS技术凭借着高通量、灵敏、全覆盖等优点显示出其临床检测的优越性。传统的Sanger测序是目前国内临床检测BRCA1和BRCA2基因突变的主要检测手段。从检测灵敏度上讲，Sanger测序一般只能检测20％以上突变率的变异，对BRCA1和BRCA2全部编码序列及邻近内含子序列检测来说，检测通量较低、周期长，单样品检测费用也较高。另外，市面上也有基于高分辨率熔点曲线分析(HighResolutionMeltingAnalysis,HRM)技术的检测试剂盒，但仅能检测几个已知位点，其作用非常有限。
技术实现思路
本专利技术的专利技术目的在于提供乳腺癌易感基因BRCA1和BRCA2检测试剂盒及方法，以提高对腺癌易感基因BRCA1和BRCA2检测的准确度。本专利技术实施例第一方面示出一种乳腺癌易感基因BRCA1和BRCA2检测试剂盒，所述试剂盒包括：第一轮PCR试剂和第二轮PCR试剂；所述试剂盒包括：第一轮PCR试剂和第二轮PCR试剂；所述第一轮PCR试剂包括：缓冲溶液，镁盐，脱氧核糖核苷三磷酸，酶混合液，第一轮PCR引物；所述第一轮PCR引物包括上游引物和下游引物；所述第二轮PCR试剂包括：缓冲溶液，镁盐，脱氧核糖核苷三磷酸，酶混合液，第二轮PCR引物；所述第一轮PCR引物包括46对BRCA1引物SEQ1-SEQ92和67对BRCA2引物SEQ93-SEQ226；每个所述上游引物的5’端添加序列SEQ227，每个所述下游引物的5’端添加序列SEQ228；所述SEQ227的核酸序列为：TCGTCGGCAGCGTCAGATGTGTATAAGAGACAG；所述SEQ228的核酸序列为：GTCTCGTGGGCTCGGAGATGTGTATAAGAGACAG。进一步，所述第二轮PCR引物包括上游通用引物P1和下游Index引物12条Index1-Index12。本专利技术实施例第二方面一种乳腺癌易感基因BRCA1和BRCA2检测方法，包括：配置第一轮PCR试剂和第二轮PCR试剂；取样本加入到所述第一轮PCR试剂中，进行第一轮PCR扩增，设置第一轮PCR扩增程序参数，进行第一轮PCR扩增，得到第一轮PCR扩增产物；将所述第一轮PCR扩增产物进行纯化，得到纯化后的第一轮PCR扩增产物；将所述纯化后的第一轮PCR扩增产物进行第二轮多重PCR扩增，设置第二轮多重PCR扩增程序参数，进行第二轮多重PCR扩增，得到第二轮多重PCR扩增产物；将所述第二轮多重PCR扩增产物进行纯化，得到纯化后的第二轮多重PCR扩增产物。进一步，所述第一轮PCR扩增程序参数为：预变性，预变性的温度为95℃，时间为10min；变性，变性的温度为95℃，时间为30s；退火，退火的温度为60℃，时间为30s；第一次延伸，延伸温度为72℃，时间为60s；第二次延伸，延伸温度为72℃，时间为5min。进一步，所述第二轮多重PCR扩增程序参数为：预变性，预变性的温度为95℃，时间为10min；变性，变性的温度为95℃，时间为20s；退火，退火的温度为60℃，时间为30s；第一次延伸，延伸温度为72℃，时间为40s；第二次延伸，延伸温度为72℃，时间为5min。进一步，将所述第一轮PCR扩增产物进行纯化，得到纯化后的第一轮PCR扩增产物的步骤包括：采用AMPurebeadsXP纯化磁珠，得到纯化后的磁珠，将所述纯化后的磁珠与第一轮PCR扩增产物1:1混合，得到磁珠与所述第一轮PCR扩增产物混合液，静置10min；所述磁珠与所述第一轮PCR扩增产物混合液置于磁架上，约3min后，吸走液体，加乙醇清洗，用20μl水洗脱，得到纯化后的第一轮PCR扩增产物20μl。进一步，所述将第二轮多重PCR扩增产物进行纯化，得到纯化后的第二轮多重PCR扩增产物；采用AMPurebeadsXP纯化磁珠，得到纯化后的磁珠，将所述纯化后的磁珠与纯化后的第一轮PCR扩增产物1:1混合；得到磁珠与所述第一轮PCR扩增产物混合液，静置10min；将磁珠与所述第一轮PCR扩增产物混合液置于磁架上，约3min后，吸走液体，加乙醇清洗，用20μl水洗脱，得到纯化后的第二轮多重PCR扩增产物20μl。进一步，所述加乙醇清洗，所述乙醇的体积180μl，所述清洗的次数为两次。进一步，所述乙醇的浓度为70％。进一步,所述乙醇的浓度为75％。由以上技术方案可知，本专利技术实施例示出一种乳腺癌易感基因BRCA1和BRCA2检测试剂盒及方法；检测试剂盒，所述试剂盒包括：第一轮PCR试剂和第二轮PCR试剂；所述第一轮PCR试剂包括：缓冲溶液，镁盐，脱氧核糖核苷三磷酸，酶混合液，第一轮PCR引物；所述第二轮PCR试剂包括：缓冲溶液，镁盐，脱氧核糖核苷三磷酸，酶混合液，第二轮PCR引物；所述第一轮PCR引物包括46对BRCA1引物SEQ1-SEQ92和67对BRCA1引物SEQ93-SEQ226，每个上游引物的5’端添加序列SEQ227，每个下游引物的5’端添加序列SEQ228；SEQ227的核酸序列为：TCGTCGGCAGCGTCAGATGTGTATAAGAGACAG；SEQ228的核酸序列为：GTCTCGTGGGCTCGGAGATGTGTATAAGAGACAG。本专利技术公开了一种乳腺癌易感基因BRCA1和BRCA2检测试剂盒及方法，所述引物组合共包含11本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种乳腺癌易感基因BRCA1和BRCA2检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括：第一轮PCR试剂和第二轮PCR试剂；所述第一轮PCR试剂包括：缓冲溶液，镁盐，脱氧核糖核苷三磷酸，酶混合液，第一轮PCR引物；所述第一轮PCR引物包括上游引物和下游引物；所述第二轮PCR试剂包括：缓冲溶液，镁盐，脱氧核糖核苷三磷酸，酶混合液，第二轮PCR引物；所述第一轮PCR引物包括46对BRCA1引物SEQ1‑SEQ92和67对BRCA2引物SEQ93‑SEQ226；每个所述上游引物的5’端添加序列SEQ227，每个所述下游引物的5’端添加序列SEQ228；所述SEQ227的核酸序列为：TCGTCGGCAGCGTCAGATGTGTATAAGAGACAG；所述SEQ228的核酸序列为：GTCTCGTGGGCTCGGAGATGTGTATAAGAGACAG。

【技术特征摘要】
1.一种乳腺癌易感基因BRCA1和BRCA2检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括：第一轮PCR试剂和第二轮PCR试剂；所述第一轮PCR试剂包括：缓冲溶液，镁盐，脱氧核糖核苷三磷酸，酶混合液，第一轮PCR引物；所述第一轮PCR引物包括上游引物和下游引物；所述第二轮PCR试剂包括：缓冲溶液，镁盐，脱氧核糖核苷三磷酸，酶混合液，第二轮PCR引物；所述第一轮PCR引物包括46对BRCA1引物SEQ1-SEQ92和67对BRCA2引物SEQ93-SEQ226；每个所述上游引物的5’端添加序列SEQ227，每个所述下游引物的5’端添加序列SEQ228；所述SEQ227的核酸序列为：TCGTCGGCAGCGTCAGATGTGTATAAGAGACAG；所述SEQ228的核酸序列为：GTCTCGTGGGCTCGGAGATGTGTATAAGAGACAG。2.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述第二轮PCR引物包括上游通用引物P1和下游Index引物12条Index1-Index12。3.一种乳腺癌易感基因BRCA1和BRCA2检测方法，其特征在于，包括：配置第一轮PCR试剂和第二轮PCR试剂；取样本加入到所述第一轮PCR试剂中，进行第一轮PCR扩增，设置第一轮PCR扩增程序参数，进行第一轮PCR扩增，得到第一轮PCR扩增产物；将所述第一轮PCR扩增产物进行纯化，得到纯化后的第一轮PCR扩增产物；将所述纯化后的第一轮PCR扩增产物加入到所述第二轮PCR试剂中，进行第二轮多重PCR扩增，设置第二轮多重PCR扩增程序参数，进行第二轮多重PCR扩增，得到第二轮多重PCR扩增产物；将所述第二轮多重PCR扩增产物进行纯化，得到纯化后的第二轮多重PCR扩增产物。4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述第一轮PCR扩增程序参数为：预变性，预变性的温度为95℃...

【专利技术属性】
技术研发人员：王军，郭鑫武，陈明，罗喜鹏，彭厘旻，戴立忠，
申请(专利权)人：湖南圣湘生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：湖南,43