一种脊髓性肌萎缩症相关基因突变检测引物及其应用制造技术

本发明专利技术涉及一种脊髓性肌萎缩症相关基因突变检测引物及其应用，所述引物包括一对特异性检测

A gene mutation detection primer for spinal muscular atrophy and its application

The present invention relates to a gene mutation detection primer for spinal muscular atrophy and its application. The primers include a pair of specific detection.

【技术实现步骤摘要】
一种脊髓性肌萎缩症相关基因突变检测引物及其应用
本专利技术涉及基因检测领域，具体涉及脊髓性肌萎缩症相关基因突变检测
，特别指一种脊髓性肌萎缩症相关基因检测方法、相关检测引物组合及检测试剂盒以及相关应用。
技术介绍
脊髓性肌萎缩症（Spinalmuscularatrophy,SMA）是一种较为常见的神经系统遗传疾病，由于脊髓前角变性引起肢体肌无力和肌萎缩的常染色体隐性遗传疾病，疾病发病率为1/6000~1/10000，携带者频率为1/40~1/60。SMA的致病基因是位于5q13的运动神经元生存（Survivalmotorneuron,SMN）基因，其主要的临床表现为进行性、对称性肢体无力及肌萎缩，近端重于远端，面肌和眼外肌不受累，目前尚无有效的治疗方案。1992年，脊髓性肌萎缩国际协作会议根据SMA患者的发病年龄和临床表现分为4型：I型（严重型）、II型（中间型）、III型（轻型）和IV型（成人型）。SMAⅠ型（Werdnig⁃Hoffman病），为最常见和最严重的一型，约有50%的患者属于I型，出生后6个月内起病，主要表现为出生时哭声低，肌张力低，不能抬头，6个月以后不能独坐，通常在2岁内死于呼吸衰竭。SMAII型于出生后7至18个月内发病，患儿能独坐但无法独立站立和行走，生存时间超可过2岁，主要依靠呼吸系统并发症发生情况而定。SMAIII型（Kugelburg⁃Welander病）于出生18个月后发病，有部分患者能独立行走，部分需要辅助器械行走，此型患者可存活至成年，但常出现脊柱侧弯。SMAIV型为成年型，临床表现较轻，成年起病，发病和疾病进展隐匿，生存时间与正常人无差别，可出现四肢无力的症状。由于SMA的临床表现、血液检查、电生理检查与病理检查均无明显特异性，因此，很难与其他运动神经元病与肌营养不良症相鉴别，近年来对SMA的临床诊断更多依赖于基因检测。SMA的致病基因为SMN1基因，约95%患者表现为SMN1纯合基因缺失，其余可呈SMN1基因微小突变。由基因检测技术检测SMN1基因的拷贝数，可以作为诊断是否为SMA患者或者携带者的一项重要依据。SMN1基因定位于5q13区域，该区域内结构复杂，存在的重复序列及众多假基因簇导致其结构不稳定，SMN1存在一个与其同源性高度相似的基因，即位于着丝粒区的SMN2基因，SMN1基因与SMN2基因仅有5个碱基的差异，故给临床基因检测带来一定的困难。目前临床上对SMA常规基因检测主要采用聚合酶链反应-限制性片段长度多态性（polymerasechainreaction-restrictionfragmentlengthpolymorphism，PCR-RFLP）、实时荧光定量PCR技术（real-timePCR）、多重连接依赖性探针扩增技术（multiplexligation⁃dependentprobeamplification，MLPA）三种技术。这三种技术各有缺点，PCR-RFLP技术仅能检测SMN1基因纯合缺失情况，无法检测SMN1基因的拷贝数；real-timePCR技术仅能用一对内参基因与目的基因比较，容易产生误差；MLPA技术可同时设计多对内参基因进行比较，但是试剂成本高、耗时长。因此，需要提供一种脊髓性肌萎缩症相关基因突变检测方法，提高检测的精确性以及检测效率。
技术实现思路
本专利技术的主要目的就是针对以上三种检测技术存在的不足，提供一种脊髓性肌萎缩症相关基因突变检测方法、相关检测引物和检测试剂盒以及相关应用。该方法设计巧妙，设计三对内参基因引物与目的基因比较，仅需进行PCR反应以及片段分析的步骤对脊髓性肌萎缩症相关基因突变进行检测，检测快速、精确，可辅助临床医师诊断，适用于大规模推广。为了实现上述目的，采用以下技术方案：一种脊髓性肌萎缩症相关基因突变检测引物，所述引物包括一对特异性检测SMN1基因7号外显子引物，其核苷酸序列为SEQIDNO.1和SEQIDNO.2，三对内参基因引物，其核苷酸序列为SEQIDNO.3、SEQIDNO.4、SEQIDNO.5、SEQIDNO.6、SEQIDNO.7、SEQIDNO.8。一种脊髓性肌萎缩症相关基因突变的检测方法，包括如下步骤：（1）提取检测对象基因组DNA；（2）采用一对特异性扩增SMN1基因7号外显子引物和三对扩增内参基因PCR引物对步骤（1）所得到的基因组DNA进行多重PCR。其中所述的特异性扩增SMN1基因7号外显子引物为SEQIDNO.1和SEQIDNO.2，三对扩增内参基因PCR引物为SEQIDNO.3、SEQIDNO.4、SEQIDNO.5、SEQIDNO.6、SEQIDNO.7、SEQIDNO.8。（3）利用基因分析仪收集荧光短片段多重PCR产生的荧光信号，并导出图型及数据。数据分析参照文献（CastellsaguéEetal，ClinChem.2008Jul;54(7):1132-40.）将SMN1基因7号片段峰面积除以三对内参基因片段峰面积和，即为该目的片段的相对峰面积（Relativepeakarea,RPA），再将病例组RPA与正常对照RPA相比，即为拷贝数比值，进而可计算出该目的片段的拷贝数。表1.拷贝数比值结果判定备注：若拷贝数比值为0~0.4或0.65~0.8此为临界值，需重新检测。在本专利技术的第三方面，提供了一种脊髓性肌萎缩症相关基因突变检测的试剂盒，所述的PCR反应液含以下组分：本专利技术的优点在于：本专利技术专利中设计的引物SEQIDNO.1和SEQIDNO.2特异性针对SMN1基因，能特异性扩增SMN1基因，检测结果不受SMN2基因影响。本试剂盒不仅可以检测SMN1基因纯合缺失情况，还能检测SMN1基因拷贝数变异情况，能辅助SMA患者临床诊断，还可用于大规模携带者筛查。与现有检测试剂盒相比，检测结果更快速、精确，成本低，满足临床低成本高通量的检测要求。附图说明图1是SMN1基因7号外显子正常检测结果图。其中，3为SMN1基因7号外显子扩增片段的信号峰，1、2、4为3对内参扩增片段的信号峰，横坐标是每个片段的位置，纵坐标是每个片段对应的信号峰高。图2是SMN1基因7号外显子缺失检测结果图。其中，3为SMN1基因7号外显子扩增片段的信号峰，1、2、4为3对内参扩增片段的信号峰，横坐标是每个片段的位置，纵坐标是每个片段对应的信号峰高。图3是SMN1基因7号外显子杂合缺失检测结果图。其中，3为SMN1基因7号外显子扩增片段的信号峰，1、2、4为3对内参扩增片段的信号峰，横坐标是每个片段的位置，纵坐标是每个片段对应的信号峰高。具体实施方式为了更好的理解本
技术实现思路
，下面结合具体实施内容进行进一步说明。本专利技术最关键的构思在于：设计三对内参基因引物与特异性扩增SMN1基因7号外显子引物进行荧光短片段多重PCR并应用基因分析仪收集相应片段荧光信号进行基因突变分析。本专利技术用带荧光标记引物进行多重PCR反应避免了MLPA技术复杂的探针杂交、连接、扩增步骤，提高检测效率；同时将目的基因与三对内参基因比较，多对内参基因比较结果准确性优于real-timePCR技术仅用单一内参。实施例1：技术基础本专利技术采用荧光短片段多重PCR结合片段分析检测方法对脊髓性肌萎缩症相关基因进行突变检测。荧光短片本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种脊髓性肌萎缩症相关基因突变检测引物，其特征在于：所述引物包括一对特异性检测SMN1基因7号外显子引物，其核苷酸序列为SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2，三对内参基因引物，其核苷酸序列为SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.5、SEQ ID NO.6、SEQ ID NO.7、SEQ ID NO.8。

【技术特征摘要】
1.一种脊髓性肌萎缩症相关基因突变检测引物，其特征在于：所述引物包括一对特异性检测SMN1基因7号外显子引物，其核苷酸序列为SEQIDNO.1和SEQIDNO.2，三对内参基因引物，其核苷酸序列为SEQIDNO.3、SEQIDNO.4、SEQIDNO.5、SEQIDNO.6、SEQIDNO.7、SEQIDNO.8。2.一种利用权利要求1所述引物检测脊髓性肌萎缩症相关基因突变的方法，其特征在于：包括如下步骤：（1）提取检测对象基因组DNA；（2）采用一对特异性扩增SMN1基因7号外显子引物和三对扩增内参基因PCR引物对步骤（1）所得到的基因组DNA进行多重PCR，其中所述引物的上游引物5’端均标记FAM荧光染料，序列如下：a．所述的一对特异性扩增SMN1基因7号外显子引物序列上游引物：5'-FAM-CTTTATTTTCCTTACAGGGTTTC-3'；下游引物：5'-GTGAAAGTATGTTTCTTCCACgT-3'；b．所述的三对扩增内参基因引物序列上游引物：5'-FAM-TTCATTGACATGCCAACAGAAG-3'；下游引物：5'-GCAAGCAGTGTTCAAATCTCAC-3'；上游引物：5'-FAM-...

【专利技术属性】
技术研发人员：陈万金，
申请(专利权)人：陈万金，
类型：发明
国别省市：福建,35