用于检测芬太尼用药相关基因多态性的引物对及试剂盒制造技术

本发明专利技术涉及一种用于检测芬太尼用药相关基因多态性的引物对及试剂盒，属于体外核酸检测技术领域。所述引物对包括正向扩增引物、反向扩增引物及测序引物，所述正向扩增引物的5’端进行生物素标记；所述试剂盒包括正向扩增引物、含有反向扩增引物的PCR反应液、测序引物、尿嘧啶DNA糖基化酶、Taq聚合酶及阳性对照品。本发明专利技术提供的所述试剂盒具有检测结果准确、特异性高、检测周期短、操作简单并能有效满足临床检验要求的优点；此外，还具可实时监测反应进程、反应时间短、PCR产物简单处理即可上焦磷酸测序仪测序，并比金标准方法，即毛细管电泳测序法灵敏度更高，更适用突变分析。

Primer pairs and kits used to detect the polymorphism of fentanyl related gene

The present invention relates to a primer pair and a kit for detecting the polymorphism of fentanyl related gene, which belongs to the field of in vitro nucleic acid detection technology. The primer pairs including forward primers, reverse primers and sequencing primers, the forward primer 5 'end labeled by biotin; the kit includes a forward primer and reverse primer containing PCR reaction solution, sequencing primer, uracil DNA glycosylase, Taq polymerase and positive control. The kit provided by the invention has accurate detection results, high specificity, simple operation, short detection cycle and can effectively meet the advantages of clinical inspection requirements; in addition, also can monitor the reaction process, short reaction time, simple processing can be the product of PCR phosphoric acid sequencing, and compared with the gold standard method capillary electrophoresis sequencing method has higher sensitivity, more suitable for mutation analysis.

【技术实现步骤摘要】
用于检测芬太尼用药相关基因多态性的引物对及试剂盒
本专利技术涉及体外核酸检测
，尤其涉及一种用于检测芬太尼用药相关基因多态性的引物对及试剂盒。
技术介绍
麻醉是施行手术时或进行诊断性检查操作时为消除疼痛、保障病人安全、创造良好的手术条件而采取的各种方法。麻醉亦用于控制疼痛，进行手术或诊断性检查操作时，病人会感到疼痛，需要用麻醉药或其他方式使之暂时失去知觉。常见的麻醉用药包括镇静药物：如咪达唑仑、丙泊酚等；中枢性镇痛药：吗啡、芬太尼等等；肌肉松弛药：阿曲库胺、顺阿曲库胺等等；局部麻醉药：利多卡因、布比卡因等等。芬太尼是人工合成的强效麻醉性镇痛药，镇痛作用机制与吗啡相似，为阿片受体激动剂，作用强度为吗啡的60～80倍。与吗啡和哌替啶相比，芬太尼作用迅速，维持时间短，不释放组胺、对心血管功能影响小，能抑制气管插管时的应激反应。芬太尼上市以后逐渐取代了吗啡在手术麻醉中主流镇痛药物的地位，成为最常被选用的麻醉镇痛药物之一。随后不断有新芬太尼类产品面世，临床可供选择的产品也越来越多。目前国内使用的产品主要是芬太尼、瑞芬太尼和舒芬太尼。芬太尼作为人工合成阿片类强效麻醉性镇痛药，在我国临床麻醉科应用非常广泛。但由于个体差异性的存在，同等剂量芬太尼在不同患者中药物效果和药物代谢具有显著差异，从而影响其镇痛效果和不良反应。芬太尼主要在肝脏内通过CYP3A4酶代谢，CYP3A4酶属于细胞色素P450氧化酶系统(CYP)，是最重要的药物代谢酶。其中CYP3A在肝微粒体P450中含量最多，占总量的一半以上，参与约60％的临床药物代谢。CYP3A4是CYP3A家族重要成员之一，控制着一些局麻药、甾体类消炎镇痛药、芬太尼类等的代谢。研究显示：使用相同剂量的芬太尼，CYP3A4基因突变会导致CYP3A4酶系产生功能性改变，使芬太尼代谢减少，相应的血药浓度增加，作用最强；突变杂合子居中；野生纯合子血药浓度最低，作用也最弱。CYP3A4在人群中广泛存在着遗传多态性现象，是引起个体间和种族间对同一底物代谢能力不同的原因之一。目前P450等位基因命名网站公布了55个基因多态性。CYP3A4等位基因频率存在显著的种族和民族差异。在中国人群中，等位基因频率最高的是CYP3A4*1G，高达27％。CYP3A4*1G型等位基因突变可引起CYP3A4代谢酶的活性发生改变，影响相关药物的代谢能力，从而影响其血药浓度。研究者在对腹式子宫全切术和子宫肌瘤剔除术患者术后芬太尼静脉镇痛研究时发现，CYP3A4*1G突变与芬太尼术后静脉镇痛效应有关，可降低术后芬太尼消耗量。闵昱源等在对CYP3A4基因多态性对大面积烧伤患者应用芬太尼镇痛的个体化用药价值时发现：CYP3A4*1G突变患者芬太尼用量明显低于对照组的患者，推测芬太尼在CYP3A4*1G基因突变个体镇痛效应引起的差异，是由于基因突变而引起酶系表达发生变化，使CYP3A4酶活性降低。麻醉科临床医师在使用芬太尼等镇痛药物时有严格限制，术中药效不足达不到麻醉标准，将影响手术效果；术后药效不足会增加患者痛苦；药物剂量过量会导致呼吸系统严重不良反应；慢性疼痛患者用量不当会造成药物依赖。个体化用药根据患者基因型合理调整用药方案，在提高疗效与用药安全性具有很大优势。本试剂盒就是用来区分不同病人的CYP3A4*1G位点的基因型，为医生临床使用芬太尼类麻醉镇痛药物提供参考，并避免术后疼痛、呼吸抑制等严重不良反应的发生。焦磷酸测序(Pyrosequencing)是一种基于聚合原理的DNA测序(即确定DNA中核苷酸的顺序)方法，属于新一代DNA序列分析技术，具备同时对大量样品进行测序分析的能力，并具有高通量、特异性高、快速、直观及低成本的优点。其基本原理为，由4种酶催化的同一反应体系中的酶级联化学发光反应，在每一轮测序反应中，只加入一种dNTP，若该dNTP与模板配对，聚合酶就可以将其掺入到引物链中并释放出等摩尔数的焦磷酸基团(PPi)，PPi可最终转化为可见光信号，并由PyrogramTM转化为一个峰值，每个峰值的高度与反应中掺入的核苷酸数目成正比；然后加入下一种dNTP，继续DNA链的合成；最后通过分析岀峰值的情况，达到测定DNA序列的目的。不过，现有技术中还没有利用焦磷酸测序技术检测CYP3A4基因分型的产品。医院用于CYP3A4基因分型检测的“金标准”是PCR-直接测序法，但直接测序法的敏感性不高，只能检测出突变细胞比率在10-20％以上的肿瘤组织，对于含<10％突变细胞的肿瘤组织以及外周血，常规PCR-直接测序法几乎无能为力。相比于直接测序法，焦磷酸测序的灵敏性更高、成本更低。目前，在现有已公开报道的文献中，只有本研究团队于2015年时所申请的中国专利CN201510672628.0对医院用于于CYP3A4基因分型检测的“金标准”(PCR-直接测序法)进行了创新改进；但是该专利CN201510672628.0所涉及的技术方案，在产品投入临床市场后，尤其是在医院大面积应用过程中，发现所设计的引物及试剂盒特异性还不是特别高，检测结果的准确性也会偶尔出现波动，推测可能是引物设计与医院实际分子诊断实验室的环境存在适应性问题；因此，引物设计优化及对应PCR体系稳定性尚有较大的改进空间；我们在多方考察各医院临床分子诊断实验室环境及统计分析有问题的检测报告结果后，全面对该项目的引物进行了重新优化设计，并优化了PCR反应体系，显著改进了试剂盒产品。
技术实现思路
为了解决上述方法检测芬太尼用药相关CYP3A4基因多态性过程中存在检测结果准确性不高、检测周期长、操作繁琐及难以满足临床检验要求的技术问题，本专利技术提供一种检测结果准确、特异性高、检测周期短、成本低、定量并有效满足临床检验要求的检测芬太尼用药相关CYP3A4*1G的基因多态性的引物对及试剂盒；采用PCR结合焦磷酸测序技术来实现。本专利技术提供了一种用于检测芬太尼用药相关基因多态性的引物对，所述芬太尼用药相关基因检测的多态性位点为CYP3A4*1G，所述引物对为焦磷酸测序引物对，其包括：正向扩增引物：5’-CCTTCCTACATAGAGTCA-3’(SEQIDNO.1)；反向扩增引物：5’-ATTGATGCAGTTTTACCC-3’(SEQIDNO.2)；测序引物：5’-CACGATTCTAGCTATGT-3’(SEQIDNO.3)；其中，所述正向扩增引物的5’端进行生物素标记。本专利技术还提供了一种用于检测芬太尼用药相关基因多态性的试剂盒，所述芬太尼用药相关基因检测的多态性位点为CYP3A4*1G，所述试剂盒包括：正向扩增引物：5’-CCTTCCTACATAGAGTCA-3’；PCR反应液，所述PCR反应液含有反向扩增引物：5’-ATTGATGCAGTTTTACCC-3’；测序引物：5’-CACGATTCTAGCTATGT-3’；其中，所述正向扩增引物的5’端进行生物素标记。在本专利技术提供的所述试剂盒的一种较佳实施例中，所述试剂盒还包括：CYP3A4*1G阳性对照品1，其为插有SEQIDNO.4所示核苷酸序列的CYP3A4*1G野生纯合子质粒；所述SEQIDNO.4所示核苷酸序列如下:CTGCCAGTAGCAACCATTTGCTATGTTTCTTTCTTTT本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种用于检测芬太尼用药相关基因多态性的引物对，其特征在于，所述芬太尼用药相关基因检测的多态性位点为CYP3A4*1G，所述引物对为焦磷酸测序引物对，其包括：正向扩增引物：5’‑CCTTCCTACATAGAGTCA‑3’；反向扩增引物：5’‑ATTGATGCAGTTTTACCC‑3’；测序引物：5’‑CACGATTCTAGCTATGT‑3’；其中，所述正向扩增引物的5’端进行生物素标记。

【技术特征摘要】
1.一种用于检测芬太尼用药相关基因多态性的引物对，其特征在于，所述芬太尼用药相关基因检测的多态性位点为CYP3A4*1G，所述引物对为焦磷酸测序引物对，其包括：正向扩增引物：5’-CCTTCCTACATAGAGTCA-3’；反向扩增引物：5’-ATTGATGCAGTTTTACCC-3’；测序引物：5’-CACGATTCTAGCTATGT-3’；其中，所述正向扩增引物的5’端进行生物素标记。2.一种用于检测芬太尼用药相关基因多态性的试剂盒，其特征在于，所述芬太尼用药相关基因检测的多态性位点为CYP3A4*1G，所述试剂盒包括：正向扩增引物：5’-CCTTCCTACATAGAGTCA-3’；PCR反应液，所述PCR反应液含有反向扩增引物：5’-ATTGATGCAGTTTTACCC-3’；测序引物：5’-CACGATTCTAGCTATGT-3’；其中，所述正向扩增引物的5’端进行生物素标记。3.根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括：CYP3A...

【专利技术属性】
技术研发人员：滕祥云，曾好，黄少亚，
申请(专利权)人：长沙三济生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：湖南,43