一种检测硫嘌呤药物SNP位点基因型的试剂盒及方法，本发明专利技术涉及分子生物学和医学领域，本发明专利技术提供一种试剂盒，针对人类基因组DNA中硫嘌呤药物不良反应风险的3个SNP位点，即TPMT*3(T>C)rs1142345，ITPA(94C>A)rs1127354，NUDT15rs116855232，设计特异性引物和野生型/突变型探针，与偶联相应报告探针的MagPlex‑TAG磁珠进行杂交反应，通过显色反应在仪器上进行检测，通过对信号值的读取判读各个SNP位点的碱基型。本发明专利技术提供的试剂盒可以灵敏、快速低检测人全血样本中3个SNP型别，可为硫嘌呤用药不良反应风险预测提供可靠的实验证据，指导临床治疗选择。
【技术实现步骤摘要】
一种检测硫嘌呤药物SNP位点基因型的检测方法及试剂盒
本专利技术涉及分子生物学和医学领域，更具体的，本专利技术涉及一种检测硫嘌呤(巯嘌呤，硫鸟嘌呤和硫唑嘌呤)不良反应风险SNP位点的试剂盒及其方法。
技术介绍
硫嘌呤(巯嘌呤，硫鸟嘌呤和硫唑嘌呤)是癌症、器官移植、自身免疫疾病(如多发性硬化症、风湿性关节炎、系统性红斑狼疮、原发性胆汁硬化症、炎症性肠炎)中最重要和广泛应用的药物之一。骨髓抑制是硫嘌呤最常见的不良反应，包括白细胞减少，巨幼细胞性贫血，血小板减少，全血细胞减少，严重者可危及生命。大多数研究人员推测，硫嘌呤引起的细胞毒性是由6-硫鸟嘌呤核苷酸(6-TGN)浓度引起的DNA损伤引起的，6-TGN浓度高的患者变化主要由硫嘌呤甲基转移酶(TPMT)活性的变化所引起，有研究表明，与对照组相比，骨髓抑制患者TPMT活性非常低，6-TGN异常高。可变的TPMT活性导致6-TGN和6-甲基巯基嘌呤核糖核苷酸代谢产物的差异产生，TPMT活性降低使代谢途径转向6-TGN的生产。亚洲人群中主要的TPMT变体为*3C，等位基因频率为2.3％。TPMT基因野生纯合型*1*1(AA)TPMT活性正常；突变杂合型*1*3C(AG)TPMT活性中度下降；突变纯合型*3C*3C(GG)，TPMT活性缺失。硫嘌呤诱导的白细胞减少在亚洲人群中很常见，核苷二磷酸连接部分X型基序15(NUDT15)是可将8-氧代-dGTP和8-氧代-dGDP转化为8-氧代-dGMP的含有164氨基酸的蛋白质，从而除去来自细胞的氧化损伤的鸟嘌呤核苷酸，使DNA损伤最小化。体外和体内研究表明，NUDT15可以负调节硫嘌呤激活，避免导致细胞毒性。目前的荟萃分析表明，NUDT15c.415C>T等位基因与给予硫嘌呤的患者发生白细胞减少的风险增加密切相关。与无基因患者相比，NUDT15c.415C>T的硫嘌呤使用者的白细胞减少风险显着增加了3.79倍。NUDT15c.415C>T变体在亚洲和西班牙裔中最常见，在欧洲和非洲人中罕见，东亚国家NUDT15变种的流行率越高，可能会导致这个人群中硫代嘌呤不耐受的过度表现。肌苷三磷酸焦磷酸酶(ITPA)催化6-TIMP的无效循环，以避免6-硫基次黄嘌呤三磷酸盐(6-thioinosinetriphosphate，6-TITP)的积累。在硫嘌呤治疗下，ITPA活性低的患者比ITPA活性高的患者更容易出现不良反应。而ITPA也由遗传决定的，ITPA94C>A(Pro32Thr，rs1127354)变体纯合的患者的ITPA酶活性低下或缺失，94C>A变体的催化活性降低可能是由于对核苷酸的亲和力受到干扰而引起的。因此，提供一种能同时检测硫嘌呤(巯嘌呤，硫鸟嘌呤和硫唑嘌呤)不良反应风险密切相关的TPMT*3、ITPA、NUDT15、TPMT*2基因的单核苷酸多态性位点(SNP)基因型，以此来评估硫嘌呤在自身免疫性疾病及其他疾病使用中的不良反应风险，很有必要。
技术实现思路
为实现上述目的，本专利技术提供一种试剂盒，该试剂盒针对人类基因组DNA中硫嘌呤药物不良反应风险的3个SNP位点，即TPMT*3(T>C)rs1142345，ITPA(94C>A)rs1127354，NUDT15rs116855232，设计特异性引物和野生型/突变型探针，与偶联相应报告探针的MagPlex-TAG磁珠进行杂交反应，通过显色反应在luminex200仪器上进行检测，通过对信号值的读取判读各个SNP位点的碱基型别进行判定。一种检测硫嘌呤药物SNP位点基因型的试剂盒，所述的试剂盒包括有如下序列的特异引物：涉及的特异探针序列如下：涉及的报告探针序列如下：一种检测硫嘌呤药物SNP位点基因型的方法，所述的方法包括如下的步骤：首先进行PCR反应，实现扩增；再进行多重OLA反应，标记和连接；然后进行杂交反应，最后进行基因型的分析。PCR反应体系如下：2xqiagenHotstarMM5ul,primermix1ul，DNA样本2ul,灭菌水2ul。PCR反应条件为95℃、15min，进行30个循环的94℃,30秒，60℃,30秒，72℃,30秒；72℃、7分钟，4℃维持。多重OLA反应如下：配制2xOLAmastermix，将OLAmastermix与PCR反应产物混合，混匀后进行连接反应。配制2xOLAmastermix包括有：10xTaqLigasebuffer2ul,40000U/ml的TaqDNALigase0.25ul，野生型探针mix1ul，突变型探针mix2ul，去离子水4.75ul。连接反应条件如下：96℃2min,30个循环的94℃15s,37℃1min；4℃维持。进一步的，杂交反应的过程如下：选择相应的报告探针的磁珠，重悬，然后将每种磁珠混合，稀释最多至100u颗/ul，用2XTmhybridizationbuffer，混合后加入磁珠混合物至每孔中，添加1-5ulOLAreaction和25uldH2O至每个孔，进行PCR反应：96℃90s,37℃30min，放于磁力板中30s-60s，使磁珠吸住，吸走上清，用1xTmhybridizationbuffer重悬磁珠，吸磁30-60s，再次吸走上清，重复用1xTmhybridizationbuffer重悬磁珠，吸磁30-60s，第三次吸走上清，用1xTmhybridizationbuffer重悬磁珠，在37℃温育15min，加入50ul反应产物至LUMINEX中分析。或者，杂交反应的过程如下：1、选择磁珠，并重悬；2、将每种磁珠混合，并稀释至100u颗/ul，用2XTmhybridizationbuffer，振荡混合；3、加入磁珠混合物至每孔中；4、添加样品至每孔中；5、进行PCR反应：96℃90s，37℃30min；6、准备6ug/mlSAPE在1xhybridizationbuffer；7、添加100ulSAPEmix，混匀；8、37℃温育15min；9、加入100ul至37℃的luminex中分析本专利技术的有益效果在于，本专利技术针对自身免疫性疾病患者服用硫嘌呤不良反应风险相关的3个SNP位点设计特异引物和探针，可分型检测3个SNP位点的型别；本专利技术提供的试剂盒可以灵敏、快速低检测人全血样本中3个SNP型别，可为硫嘌呤用药不良反应风险预测提供可靠的实验证据，指导临床治疗选择。具体实施方式实施例1本专利技术提供一种检测硫嘌呤药物SNP位点基因型的试剂盒，所述的试剂盒包括有如下序列的引物：所述的试剂盒还包括序列如下的特异探针：所述的试剂盒还包括序列如下的报告探针：实施例2本专利技术提供一种一种检测硫嘌呤药物SNP位点基因型的方法，该方法包括如下步骤：PCR反应：3个SNP位点在同一管进行PCR反应，反应的体系为总体积10μl，包含：2xqiagenHotstarMM5ul，primermix1ul，DNA样本2ul，灭菌水2ul。在ABI9700型PCR扩增仪上进行反应，反应条件为：95℃、15min，进行30个循环的94℃,30秒，60℃,30秒，72℃,30秒；72℃、7分钟，4℃维持。多重OLA反应：(1)本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种检测硫嘌呤药物SNP位点基因型的试剂盒，其特征在于，所述的试剂盒包括有如下序列的引物：
【技术特征摘要】
1.一种检测硫嘌呤药物SNP位点基因型的试剂盒，其特征在于，所述的试剂盒包括有如下序列的引物：2.如权利要求1所述的一种检测硫嘌呤药物SNP位点基因型的试剂盒，其特征在于，所述的试剂盒还包括特异探针，所述的特异探针序列如下：3.如权利要求1所述的一种检测硫嘌呤药物SNP位点基因型的试剂盒，其特征在于，所述的试剂盒还包括报告探针，所述的报告探针序列如下：4.一种检测硫嘌呤药物SNP位点基因型的方法，其特征在于，所述的方法包括如下的步骤：首先进行PCR反应，实现扩增；再进行多重OLA反应，标记和连接；然后进行杂交反应，最后进行基因型的分析。5.如权利要求4所述的一种检测硫嘌呤药物SNP位点基因型的方法，其特征在于，PCR反应体系如下：2xqiagenHotstarMM5ul,primermix1ul，DNA样本2ul,灭菌水2ul；PCR反应条件为95℃、15min，进行30个循环的94℃,30秒，60℃,30秒，72℃,30秒；72℃、7分钟，4℃维持。6.如权利要求4所述的一种检测硫嘌呤药物SNP位点基因型的方法，其特征在于，多重OLA反应如下：配制2xOLAmastermix，将OLAmastermix与PCR反应产物混合，混匀后进行连接反应。7.如权利要求6所述的一种检测硫嘌呤药物SNP位点基因型的方法，其特征在于，配制2xOLAmastermix包括有：10xTaqLigasebuffer2ul,40000U/ml的TaqDNALigase0.25ul，野生型探针mix1ul，突变型探针mix2ul，去离子水4.75ul。8.如权利...
【专利技术属性】
技术研发人员：杜予和，黄尚春，陈萌萌，
申请(专利权)人：广州和康医疗技术有限公司，
类型：发明
国别省市：广东,44
还没有人留言评论。发表了对其他浏览者有用的留言会获得科技券。