血栓病易感基因联合检测试剂盒及其基因芯片检测法制造技术

本发明专利技术公开了一种血栓病易感基因联合检测试剂盒及其基因芯片检测法，试剂盒包括PCR扩增试剂混合物、PCR扩增引物混合物、杂交缓冲液、阴性参考品、阳性参考品、SSC、10%SDS和50测试/盒基因芯片，采用该测试盒经过样本采集、芯片洗脱液配制、样本处理、PCR扩增及标记、杂交、洗脱和扫描及结果判定七个步骤快速、准确、客观定性检测人类基因组DNA中与血栓生成易感因素相关的基因多态性位点：rs6025、rs1613662、rs1799963、rs6048、rs12343867、rs1801133和rs4244285。

Joint detection kit for susceptibility gene of thrombus and its gene chip detection method

The invention discloses a thrombus disease susceptibility gene detection kit and gene chip assay kit includes PCR amplification reagent mixture, PCR primer mixture, hybridization buffer, negative and positive reference reference, SSC, 10%SDS and 50 / box test gene chip, using the test box by sample acquisition and chip preparation, sample processing, eluent PCR amplification and labeling, hybridization, elution and scanning and determination of the susceptible gene polymorphism of factors related to the seven steps of rapid, accurate and objective qualitative detection of human genomic DNA and thrombus formation: rs6025, rs1613662, rs1799963, rs6048, rs12343867, rs1801133 and rs4244285.

【技术实现步骤摘要】
血栓病易感基因联合检测试剂盒及其基因芯片检测法
本专利技术涉及一种血栓病易感基因联合检测试剂盒及其基因芯片检测法。
技术介绍
血栓病是一种死亡率颇高的病症，其形成病症包括所有影响血流的病理状态的病症，与血管阻塞导致的减少血流相关或与增加的出血倾向相关。动脉血栓形成，见于冠状动脉硬化性心脏病，当冠状动脉分支或主干形成血栓引起心肌缺血时，可出现心绞痛或心肌梗死；脑动脉血栓形成可导致过性脑缺血发作、脑梗死引起偏瘫、意识障碍或视网膜中心动脉闭塞引起双目失明周围动脉闭塞可引起肢体缺血性坏死等症状。静脉血栓形成见于血栓性静脉炎或深静脉血栓形成和肺栓塞；微循环血栓形成，见于溶血性尿毒症、爆发性紫癜和弥散性血管内凝血等症状。目前，患者或主治医生通常不能意识到上述病症发病前的潜在因素，直到所述因素爆发最终导致上述病症的出现，难以挽救。为此，极为需要能够用于识别血管变性的诊断方法和手段，使得人们能够尽可能早地做出诊断和相应地进行治疗性干预。
技术实现思路
针对上述现有技术中存在的不足，本专利技术提供一种血栓病易感基因联合检测试剂盒及其基因芯片检测法，适用于快速、准确、客观定性检测人类基因组DNA中与血栓生成易感因素相关的基因多态性位点：rs6025、rs1613662、rs1799963、rs6048、rs12343867、rs1801133和rs4244285。本专利技术通过如下技术方案予以实现：一种血栓病易感基因联合检测试剂盒，包括试剂盒Ⅰ和试剂盒Ⅱ，试剂盒Ⅰ由3管660μl/管PCR扩增试剂混合物、1管410μl/管PCR扩增引物混合物、1瓶4.2ml/瓶杂交缓冲液、1管125μl/管阴性参考品和1管125μl/管阳性参考品组成，所述PCR扩增试剂混合物由HotStartTaq酶、UNG酶、dUTP、dNTP、缓冲系统组成，所述PCR扩增引物混合物由引物组成，所述杂交缓冲液由Tris-Hcl、TritonX-100、NaCl、甲酰胺、blocking组成，所述阴性参考品由纯化水组成，所述阳性参考品由质粒组成；所述试剂盒Ⅱ由2瓶45ml/瓶20×SSC、1瓶40ml/瓶10％SDS和1盒50测试/盒基因芯片组成。所述试剂盒Ⅰ：-18℃以下避光保存，有效期6个月；包装打开后，4℃储存，有效期1个月；所述试剂盒Ⅱ：室温10-30℃下、避光保存，有效期6个月。本专利技术血栓病易感基因联合检测试剂盒的基因芯片检测法，包括如下步骤：(1)样本采集：采集口腔上皮细胞标本，先用清水漱口，将棉拭子伸入口腔中，在口腔内侧脸颊粘膜处左右各刮拭10次，在刮拭的同时棉签要转动，将取样后的棉拭子放入无菌采样管中密封送检；(2)芯片洗脱液配制：在芯片洗脱容器中按照蒸馏水或纯化水：20×SSC：10％SDS＝100：5：1配制洗脱液Ⅰ，按照蒸馏水或纯化水：20×SSC：10％SDS＝400：1：4配制洗脱液Ⅱ，洗脱液配制总体积应满足浸没芯片；(3)样本处理：向采样管中加入1ml无菌生理氯化钠，充分震荡混匀，挤干棉拭子，将全部液体转移至无菌1.5ml离心管中，12,000rpm离心5min，弃上清，沉淀中加入无菌生理氯化钠1ml混匀，12,000rpm离心5min，弃上清，沉淀中加入100μl核酸提取液，震荡混匀后100℃恒温处理10min，震荡混匀后12,000rpm离心5min，上清液即为临床样本DNA；取5μl参考品，加入50μlDNA提取液，震荡混匀后100℃恒温处理10min，震荡混匀后12,000rpm离心5min，上清液为参考品DNA；(4)PCR扩增及标记：取临床样本DNA或参考品DNA5μl、PCR扩增试剂混合物12.5μl、PCR扩增引物混合物7.5μl于0.2mlPCR薄壁管中进行扩增及标记；(5)杂交：将恒温台或杂交箱开启升温恒定到42℃，用杂交模块将芯片固定好，预热10min，将PCR产物加热至95℃变性5min，PCR产物变性完毕取出后，立即冰浴3min，取75μl经42℃预热的杂交缓冲液和25μl临床样本扩增-标记产物充分混匀，将混合物全部滴加在芯片矩阵位置，将杂交模块水平放置42℃恒温箱或恒温台上杂交60min；(6)洗脱：将芯片放入洗脱容器中，在37℃恒温水浴摇床100rpm震荡条件下进行洗脱；洗脱流程：洗脱液Ⅰ，1min；洗脱液Ⅱ，1min，洗脱完毕后，将芯片自然晾干或用低速离心机甩干即可进行扫描；(7)扫描及结果判定：将干燥后的芯片置于激光扫描仪中使用532nm波长激光扫描，获得扫描数据及图谱，对检测数据进行分析，生成检测报告，HC为杂交对照点探针，NC为阴性参考点探针，IC为提取对照点探针，W表示该基因的正常基因型检测探针，M代表该基因的突变基因型检测探针，先判断对照NC，若其3个重复位点中，满足“阳性”的位点数≥2，则继续判断对照HC，若其3个重复位点中，满足“阳性”的位点数≥2，则继续进行判断对照IC，若其3个重复位点中，满足“阳性”的位点数≥2，则判读结果为“成功”，否则判读结果为“失败”；W/M探针荧光值≥2.0，判读为野生型，0.5＜W/M探针荧光值＜1.5，判读为杂合型，W/M探针探针荧光值≤0.5，判读为突变型。所述步骤(1)采集的待测样本采用冰壶或泡沫箱加冰袋密封运输，在2-8℃保存不应超过24小时，-18℃以下保存不超过三个月，-70℃以下长期保存。所述步骤(2)中若10％SDS出现白色絮状沉淀，于42℃条件加热至溶液透明后再使用，洗脱液一次配制可连续使用15天，每个试剂盒中提供的洗脱液在一个月内用完。附图说明图1为本专利技术的芯片微阵列区位置。具体实施方式下面结合附图及具体实施例对本专利技术作进一步说明。本专利技术提供的试剂盒采用DNA聚合酶链式反应(PolymeraseChainReaction)技术，对待测样本进行扩增和荧光标记，将扩增标记产物与基因芯片上特异的探针进行杂交，通过荧光扫描设备获得杂交数据，分析检测数据从而判断被检样品中各位点的基因型。本试剂盒分两个部分，必需配合使用。不同批号、不同包装试剂盒中各组份禁止互换使用。具体组成成份如下表1：本专利技术提供的试剂盒的运输、储存条件及有效期为：试剂盒Ⅰ：-18℃以下避光保存，有效期6个月；包装打开后，4℃储存，有效期1个月。试剂盒Ⅱ：室温(10-30℃)、避光保存，有效期6个月。本专利技术提供的试剂盒的适用仪器：AxonGenePix4000A/B，晶芯LuxScan10K生物芯片激光扫描仪。所述的血栓病易感基因联合检测试剂盒的基因芯片检测法，样本要求为：1、采集：采集口腔上皮细胞标本。先用清水漱口，将棉拭子伸入口腔中，在口腔内侧脸颊粘膜处左右各刮拭10次，在刮拭的同时棉签要转动。将取样后的棉拭子放入无菌采样管中密封送检。(不能用手触摸棉签头部，以免污染)2、存放：待测样本在2-8℃保存不应超过24小时，-18℃以下保存不超过三个月；-70℃以下长期保存。3、运输：采用冰壶或泡沫箱加冰袋密封运输。检验方法方法如下：1仪器和耗材1.1无菌操作台；1.2基因扩增(PCR)仪(适用0.2mlPCR薄壁管)；1.3取样器(0.5-10μl、40-200μl、200-1000μl)；1.4台式离心机(转速可达12,000rpm)；1.5恒温培养箱(可恒温42℃)或可本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种血栓病易感基因联合检测试剂盒，其特征在于，包括试剂盒Ⅰ和试剂盒Ⅱ，所述试剂盒Ⅰ由3管660μl/管PCR扩增试剂混合物、1管410μl/管PCR扩增引物混合物、1瓶4.2ml/瓶杂交缓冲液、1管125μl/管阴性参考品和1管125μl/管阳性参考品组成，所述PCR扩增试剂混合物由Hot Start Taq酶、UNG酶、dUTP、dNTP和缓冲系统组成，所述PCR扩增引物混合物由引物组成，所述杂交缓冲液由Tris‑Hcl、TritonX‑100、NaCl、甲酰胺和blocking组成，所述阴性参考品由纯化水组成，所述阳性参考品由质粒组成；所述试剂盒Ⅱ由2瓶45ml/瓶20×SSC、1瓶40ml/瓶10%SDS和1盒50测试/盒基因芯片组成。

【技术特征摘要】
1.一种血栓病易感基因联合检测试剂盒，其特征在于，包括试剂盒Ⅰ和试剂盒Ⅱ，所述试剂盒Ⅰ由3管660μl/管PCR扩增试剂混合物、1管410μl/管PCR扩增引物混合物、1瓶4.2ml/瓶杂交缓冲液、1管125μl/管阴性参考品和1管125μl/管阳性参考品组成，所述PCR扩增试剂混合物由HotStartTaq酶、UNG酶、dUTP、dNTP和缓冲系统组成，所述PCR扩增引物混合物由引物组成，所述杂交缓冲液由Tris-Hcl、TritonX-100、NaCl、甲酰胺和blocking组成，所述阴性参考品由纯化水组成，所述阳性参考品由质粒组成；所述试剂盒Ⅱ由2瓶45ml/瓶20×SSC、1瓶40ml/瓶10%SDS和1盒50测试/盒基因芯片组成。2.根据权利要求1所述的血栓病易感基因联合检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒Ⅰ技术要求为：-18℃以下避光保存，有效期6个月；包装打开后，4℃储存，有效期1个月；所述试剂盒Ⅱ技术要求为：室温10-30℃下、避光保存，有效期6个月。3.权利要求1所述的血栓病易感基因联合检测试剂盒的基因芯片检测法，其特征在于，包括如下步骤：（1）样本采集：采集口腔内上皮细胞标本，先用清水漱口，将棉拭子伸入口腔中，在口腔内侧脸颊粘膜处左右各刮拭10次，在刮拭的同时棉签要转动，将取样后的棉拭子放入无菌采样管中密封送检；（2）芯片洗脱液配制：在芯片洗脱容器中按照蒸馏水或纯化水：20×SSC：10%SDS=100：5：1配制洗脱液Ⅰ，按照蒸馏水或纯化水：20×SSC：10%SDS=400：1：4配制洗脱液Ⅱ，洗脱液配制总体积应满足浸没芯片；（3）样本处理：向采样管中加入1ml无菌生理氯化钠，充分震荡混匀，挤干棉拭子，将全部液体转移至无菌1.5ml离心管中，12,000rpm离心5min，弃上清，沉淀中加入无菌生理氯化钠1ml混匀，12,000rpm离心5min，弃上清，沉淀中加入100μl核酸提取液，震荡混匀后100℃恒温处理10min，震荡混匀后12,000rpm离心5min，上清液即为临床样本DNA；取5μl参考品，加入50μlDNA提取液，震荡混匀后100℃恒温处理10min，震荡混匀后12,000...

【专利技术属性】
技术研发人员：王放，
申请(专利权)人：吉林寰基生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：云南,53