用于干扰素治疗慢性乙型肝炎早期病毒学反应的预测模型及检测试剂盒制造技术

本发明专利技术属于医学分子生物学领域。涉及干扰素治疗慢性乙型肝炎的疗效预测，具体涉及血浆miRNA联合ALT表达水平预测干扰素治疗慢乙肝早期病毒学反应预测模型，还涉及检测血浆miRNA水平的方法和试剂盒。本发明专利技术通过将血浆中miR‑22、miR‑210以及ALT作为预测因子，将其表达水平和血浆中ALT水平进行统计学分析,代入预测公式后进行类别判断,结果显示，其预测准确度为87.4%，敏感度和特异度分别为80.6%、83.3%。本发明专利技术将有助于降低治疗费用并提高干扰素治疗慢性乙型肝炎完全应答的比例；本发明专利技术的相应的检测方法方便、快速、成本较低；本发明专利技术的相应检测试剂盒检测效率高效、成本低廉。

Prediction model and detection kit for the early virological response of interferon in the treatment of chronic hepatitis B

【技术实现步骤摘要】
用于干扰素治疗慢性乙型肝炎早期病毒学反应的预测模型及检测试剂盒
本专利技术属医学分子生物学
，涉及干扰素治疗慢性乙型肝炎的疗效预测，具体涉及血浆miRNA联合ALT表达水平预测干扰素治疗慢乙肝早期病毒学反应，还涉及检测血浆miRNA水平的方法和试剂盒。
技术介绍
现有技术公开了乙型肝炎病毒（HBV）感染是一个重要的全球健康问题。研究显示，HBV感染能引起多种慢性肝脏疾病，包括无症状慢性HBV携带感染、慢性肝炎甚至进展为肝纤维化、肝衰竭以及肝癌。调查显示，在亚洲，成年HBV感染者中5%-10%发展成为慢性乙型肝炎，每年有超过50万中国人死于HBV相关的肝脏疾病。业内认为，HBV感染是一个复杂的疾病进程涉及到肝细胞、HBV以及免疫系统的相互作用，其慢性化的准确机制仍不是很清楚，因此，抗病毒治疗的主要目的是希望能够清除或长期地抑制病毒复制，从而降低或减缓肝脏疾病的进程。针对慢性乙型肝炎现有的治疗选择包括核苷类似物(NUCs)和聚乙二醇干扰素a-2a(Peg-IFN)，其中，核苷类似物的抗病毒作用主要体现在抑制病毒聚合酶活性，实践显示，核苷类似物在慢乙肝患者的长期治疗中可以有效地维持对HBV复制水平的抑制，但是长期使用核苷类似物可能出现抗病毒耐药，停药后容易出现复发；Peg-IFN是治疗慢乙肝的重要一线药物，特别是对于HBeAg阳性的病人，能够促使其中30-40%的病人实现HBeAg血清学转化，但是，仍然有多数患者接受Peg-IFN治疗后的结局并不理想（近70%患者对治疗无应答），而且IFN治疗往往会带来如流感样症状、白细胞及血小板减少等副作用；因此，为了提高干扰素治疗的整体应答率以及减少不良反应的出现，在慢乙肝病人接受干扰素治疗前，筛选出有可能受益于该治疗的病人显得尤为重要。研究表明在HBeAg阳性及阴性病人中，一些病毒和宿主特性可能与治疗反应性相关，然而，只有部分病人对Peg-IFN的治疗反应变异性可以被这些特性解释，治疗效果可能也由肝内其他因素决定。已经有若干研究致力于明确抗病毒反应与聚乙二醇干扰素(Peg-IFN)疗效的相关性，有报道称，对于HBeAg阳性的慢乙肝病人而言，低基线HBVDNA、高基线ALT水平与干扰素治疗的良好结局有着独立相关性；此外，肝内基因HLA-DPB1、SERPIN-E1联合HBeAg状态、HBV基因型、HBsAg基线水平形成的多参数模型能够正确区分90%的病人，其中HLA-DPB1、SERPIN-E1可以作为独立的预测因子；这些研究提示某些细胞因子或临床指标可能可以作为预测干扰素疗效的指标，但是目前仍然存在包括预测准确度低、病例数不足、预测参数繁多等若干问题，这方面仍然有很多工作值得深入。目前已知的与治疗疗效相关的因素有：1.治疗前ALT水平，2.治疗前HBVDNA水平,3.治疗前HBsAg水平，4.性别，5.肝脏组织学状态，6.治疗过程中HBsAg滴度动态变化等等；然而，目前相关指标的预测能力尚有限，急需一种能在血液中方便检测到的，有较高预测准确度的分子标志物及预测模型。
技术实现思路
本专利技术的目的在于克服现有技术存在的缺陷，提供一种能在血液中方便检测到的，有较高预测准确度的分子标志物及预测模型；尤其涉及血浆miRNA联合ALT表达水平预测干扰素治疗慢乙肝早期病毒学反应，及检测血浆miRNA水平的方法和试剂盒。本专利技术提供了用于预测干扰素治疗慢性乙型肝炎早期病毒学反应的预测因子及其预测模型，其包括：两种血浆miRNA以及ALT；同时提供了相应的、高效的检测血浆miRNA表达水平的方法。本专利技术通过将血浆中miRNA表达水平和血浆中ALT水平进行统计学分析,代入预测公式后进行类别判断,用于临床判断干扰素治疗慢性乙型肝炎的早期疗效；与现有技术相比，本专利技术的预测因子及其预测模型具有芯片筛选的基础并且在两个独立的慢乙肝病人样本群中得到了验证，有助于慢性乙肝患者个体化治疗的开展，提高干扰素治疗慢性乙型肝炎完全应答的比例、并最终降低治疗费用。本专利技术基于现有技术的基础，MicroRNAs（miRNAs）是一类非编码小分子RNA（19-23个核苷酸），又称小RNA（miRNA）。小RNA存在于各类组织中，可以调节体内约30%的基因表达。它们可以靶向目标mRNA通过与特异性靶mRNA的3’翻译末端进行核苷酸配对来促进其降解或抑制翻译，从而参与到很多细胞活动中包括细胞分化、增殖、凋亡等。miRNA是由长前体RNA进行转录产生，并被Drosha（一种核酸酶）预处理后通过exportin-5介导的出核过程转运到细胞浆。miRNA进一步被DICER酶剪切，最后形成17-24个核苷酸的成熟miRNA，并与RISC复合体结合，执行基因沉默功能。有研究公开了在人类血浆和血清中存在miRNAs并且具有高度稳定性和RNA酶抵抗性，这为miRNAs作为分子标记物提供了可能性。具体的，本专利技术提供了一种预测干扰素治疗慢性乙型肝炎早期病毒学反应的预测模型，该预测模型包括三种预测因子：两种血浆miRNAs以及ALT。并且，基于该预测模型本专利技术提供了一种预测干扰素治疗慢性乙型肝炎疗效的试剂盒，该试剂盒中含有针对两种血浆miRNA的特异性探针核苷酸。同时，本专利技术提供了一种预测干扰素治疗慢性乙型肝炎早期病毒学反应的预测公式，即检测两种血浆miRNA以及ALT在干扰素使用前的血浆、血清样品中的表达水平，将样品中预测因子的表达水平利用统计学方法分析并对干扰素疗效进行预测。本专利技术中，所述miRNAs中至少一种的表达水平高于或者低于已知的标准水平。进一步，本专利技术提供了一种预测干扰素治疗慢性乙型肝炎早期病毒学应答的方法，该方法包括：（1）血浆、血清样本总RNA的抽提，（2）总RNA样本采用特异性miRNAs逆转录引物进行逆转录以获得cDNA，（3）采用特异性miRNAs前向PCR引物以及通用反向引物进行qRT-PCR反应以获得两种血浆miRNAs的表达水平，（4）慢乙肝病人接受干扰素治疗前，两种血浆miRNAs的表达水平联合ALT水平，利用统计学方法进行分析，用于预测干扰素治疗慢乙肝病人的早期病毒学反应。本专利技术中，所述的统计方法分析样品中预测因子的表达水平与标准水平差异的显著性，包括下列各项中的一个或者几个：（1）采用MannWhitneytest比较并筛选出有统计学差异的血浆miRNAs；（2）将有统计学差异的并进过筛选的miRNAs以及重要的临床指标放入二元logistic回归中建立预测模型并获得相应的预测公式，同时得到相应的ROC曲线和预测准确度；（3）在另一个独立的样本群中，将预测因子的表达水平代入已建立好的预测公式中计算出相应概率值（P值），并进一步得到相应的ROC曲线和预测准确度。本专利技术中，利用本专利技术提供的两种血浆miRNAs联合ALT的表达谱分析了75例接受干扰素治疗的HBV患者样本，其预测准确度为87.4%，敏感度和特异度分别为80.6%、83.3%。本专利技术进一步在另外37例接受干扰素治疗的HBV患者中验证了此预测模型，并取得了81.6%的预测准确度，相应的敏感度和特异度分别为78.9%和94.4%。本专利技术提供了一种预测模型，能够以较高准确度预测干扰素治疗慢性乙型肝炎的早期病毒学反应。与其他已知的与疗效相关因素本文档来自技高网...

【技术保护点】
用于干扰素治疗慢性乙型肝炎早期病毒学反应的预测模型，其特征在于，该预测模型包括三种预测因子、相应检测方法和预测公式；所述的预测因子是血浆miRNAs选自miR‑22、miR‑210以及ALT作为预测因子，所述的相应检测方法包括，检测获得的检测血浆样品中两种特异性血浆miRNAs的表达水平，并结合接受干扰素治疗前的ALT水平，预测干扰素治疗对慢乙肝患者的早期病毒学反应；所述的预测公式包括，检测两种血浆miRNA以及ALT在干扰素使用前的血浆、血清样品中的表达水平，将样品中预测因子的表达水平利用统计学方法分析并对干扰素疗效进行预测。

【技术特征摘要】
1.用于干扰素治疗慢性乙型肝炎早期病毒学反应的预测模型，其特征在于，该预测模型包括三种预测因子、相应检测方法和预测公式；所述的预测因子是血浆miRNAs选自miR-22、miR-210以及ALT作为预测因子，所述的相应检测方法包括，检测获得的检测血浆样品中两种特异性血浆miRNAs的表达水平，并结合接受干扰素治疗前的ALT水平，预测干扰素治疗对慢乙肝患者的早期病毒学反应；所述的预测公式包括，检测两种血浆miRNA以及ALT在干扰素使用前的血浆、血清样品中的表达水平，将样品中预测因子的表达水平利用统计学方法分析并对干扰素疗效进行预测。2.按权利要求1所述的用于干扰素治疗慢性乙型肝炎早期病毒学反应的预测模型，其特征在于，所述的预测公式为：logit(p)=-14.856+0.012*ALT-0.519*miR-22+3.831*miR-210，以及相关的概率值P值。3.按权利要求1所述的用于干扰素治疗慢性乙型肝炎早期病毒学反应的预测模型，其特征在于，所述的相应检测方法中，所述miRNA中至少一种的表达水平高于或者低于已知的标准水平。4.按权利要求1所述的用于干扰素治疗慢性乙型肝炎早期病毒学反应的预测模型，其特征在...

【专利技术属性】
技术研发人员：袁正宏，李晋，张小楠，邬敏，张继明，张占卿，陈良，
申请(专利权)人：上海市公共卫生临床中心，
类型：发明
国别省市：上海,31