本发明专利技术提供了一种ABCC3‑013 mRNA在制备检测氯吡格雷抵抗的试剂盒中的应用，ABCC3‑013 mRNA的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。其可通过检测患者体内（例如外周血）ABCC3‑013 mRNA表达水平来检测患者的氯吡格雷抵抗，为辅助临床治疗、判断预后及疗效提供新方法。本发明专利技术还提供了检测氯吡格雷抵抗的试剂盒，其可通过检测患者体内（例如外周血）ABCC3‑013 mRNA表达水平来检测患者的氯吡格雷抵抗。临床实验表明其诊断敏感性为52%，特异性为86%。
The application of ABCC3-013 mRNA in the preparation of the kit for the detection of clopidogrel resistance and its kit
The invention provides a ABCC3 013 mRNA in the preparation of application kit for detection of clopidogrel resistance in the nucleotide sequence of ABCC3 013 mRNA as shown in SEQ ID NO.2. It can be detected by the patient (e.g. peripheral blood) ABCC3 013 to detect the expression level of mRNA in patients with clopidogrel resistance, for judging the prognosis and curative effect to provide a new method for clinical treatment, auxiliary. The invention also provides a kit for detection of clopidogrel resistance, which can be detected by the patient (e.g. peripheral blood) ABCC3 013 to detect the expression level of mRNA in patients with clopidogrel resistance. The clinical test showed that the sensitivity of the diagnosis was 52% and the specificity was 86%.
【技术实现步骤摘要】
ABCC3-013mRNA在制备检测氯吡格雷抵抗的试剂盒中的应用及其试剂盒
本专利技术涉及一种检测药物抵抗的试剂盒，尤其是一种检测氯吡格雷抵抗的试剂盒。
技术介绍
氯吡格雷作为抗血小板药物，是冠心病患者经皮冠状动脉介入术(PCI)植入支架后，用来预防支架内血栓发生的最常用药物，与阿司匹林合用所组成的“双抗血小板治疗”方案是急性冠脉综合征和PCI植入支架后的“金标准”抗血小板治疗方案。氯吡格雷抵抗（或耐受）出现在10-40%的服用氯吡格雷治疗的病人，表现为氯吡格雷的抗血小板作用达不到预期的要求，导致药物疗效差。现有的血小板聚集试验和血栓弹力图法可在一定程度上评价氯吡格雷抵抗；但是血小板聚集试验重复性较差；血栓弹力图的检测方法的不统一、评价标准不统一，并不能据此指导临床治疗。目前所采用的病人外周血白细胞DNA检测CYP2C19基因型的方法，仅能反映约10%的病人在服用氯吡格雷后临床疗效的个体差异，诊断或预测价值有限。氯吡格雷抵抗的机制尚不十分清楚，临床上也缺少有效的氯吡格雷抵抗的标记物。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种新的氯吡格雷抵抗的标记物在制备检测氯吡格雷抵抗的试剂盒中的应用，以辅助临床治疗、判断预后及疗效。本专利技术的另一个目的是提供一种检测氯吡格雷抵抗的试剂盒，以辅助临床治疗、判断预后及疗效。本专利技术提供了一种ABCC3-013mRNA在制备检测氯吡格雷抵抗的试剂盒中的应用，ABCC3-013mRNA的核苷酸序列如SEQIDNO.2所示。本专利技术还提供了一种检测氯吡格雷抵抗的试剂盒，其包括对应于ABCC3-013mRNA的特异性引物、探针、和/或芯片，ABCC3-013mRNA的核苷酸序列如SEQIDNO.2所示。在检测氯吡格雷抵抗的试剂盒的另一种示意性实施方式中，特异性引物包括SEQIDNO.5和SEQIDNO.6所示的引物。在检测氯吡格雷抵抗的试剂盒的另一种示意性实施方式中，还进一步包括：TRIZOL试剂，氯仿，异丙醇，DEPC水，OligodT引物，随机6核苷酸引物，反转录酶，无RNA酶水，反转录缓冲液，Taq酶，dNTP，Mg2+，SYBRGreenI，和ROX参比染料。多药耐药相关蛋白（MRP3）是ABCC3基因（ATPbindingcassette，subfamilyC，member3）表达的产物。临床研究表明，MRP3的高表达与多种抗癌化疗药物的治疗耐受有关。ABCC3基因在RNA转录水平上因剪接变异而产生多种mRNA剪接变异体，其中ABCC3-013剪接变异体是ABCC3基因由于点突变导致mRNA剪接异常而产生的非野生型mRNA剪接变异体。ABCC3-013剪接变异体能够增强MRP3蛋白介导的转运活性。临床研究显示，氯吡格雷抵抗的病人的ABCC3-013mRNA表达水平显著高于氯吡格雷反应敏感（或正常）的病人的表达水平。因此，可以通过检测患者体内（例如外周血）ABCC3-013mRNA表达水平来检测患者的氯吡格雷抵抗，辅助临床治疗、判断其疗效和预后。本专利技术提供了检测氯吡格雷抵抗的试剂盒，其可通过检测患者体内（例如外周血白细胞）ABCC3-013mRNA表达水平来检测患者的氯吡格雷抵抗。临床实验表明其诊断敏感性为52%，特异性为86%，可有助于辅助临床治疗、判断其疗效和预后。附图说明以下附图仅对专利技术做示意性说明和解释，并不限定本专利技术的范围。图1：血清ABCC3-013mRNA诊断氯吡格雷抵抗的ROC曲线。图2：EGFP蛋白在各组细胞中的表达。图3：ABCC3-002和ABCC3-013在各稳定转染细胞株中的表达情况。图4：各稳定转染细胞株的外排转运功能检测。图5：氯吡格雷敏感反应患者和低反应（抵抗）患者中ABCC3-002和ABCC3-013mRNA的相对表达水平。具体实施方式为了对专利技术的技术特征、目的和效果有更加清楚的理解，现结合以下实施例说明本专利技术的具体实施方式。实施例1：ABCC3-013mRNA在制备检测氯吡格雷抵抗的试剂盒中的应用。一、检测氯吡格雷抵抗的试剂盒，包括如下成分：TRIZOL试剂，氯仿，异丙醇，DEPC水，OligodT引物（OligodTprimer），随机6核苷酸引物（Random6-mers），反转录酶（PrimeScriptTMRTEnzymeMix），无RNA酶水（RNase-freedH2O），反转录缓冲液（PrimeScriptTMbuffer），Taq酶，dNTP，Mg2+，SYBRGreenI（SYBRPremixExTaqTM），ROX参比染料（ROXReferenceDye），和针对ABCC3-013mRNA（核苷酸序列如SEQIDNO.2所示）的特异性引物SEQIDNO.5和SEQIDNO.6。二、试剂盒的使用方法提取患者外周血RNA，用qRT-PCR检测其中ABCC3-013mRNA的含量，具体操作如下所示。1、外周血RNA的提取：1）250μl血浆，加入750μlTrizol；2）摇晃3至5次，用移液器充分吹打后转移至1.5mlEP管中；3）室温下静置10min；4）加200μl氯仿，上下剧烈晃动或者涡旋震动15s，室温下静置5min；5）12,000×g、4℃离心15min；6）吸取含有总RNA的上清转移至新的1.5mlEP管中，加入500μl异丙醇后颠倒混匀，室温下静置10min；7）12,000×g、4℃离心10min，弃上清；8）加入1ml75%乙醇（由DEPC水配制），涡旋振荡混匀；9）7,500×g、4℃离心5min，弃上清；10）按照上一步的离心条件进行离心，吸尽多余液体；11）待RNA略干之后，加20μlDEPC水，-80℃保存备用。2、RNA定量与纯度测定取上述RNA1μl，加去离子水99μl稀释100倍，测定其在260nm以及280nm处的光密度值（即OD260与OD280），并计算二者比值，判断RNA的纯度。比值小于1.6表明样品中含有蛋白质，大于1.9表明样品纯度很高，介于二者之间表明含有不同程度的DNA。根据测得的OD260值计算稀释前的RNA浓度，公式如下：RNA（μg/μl）=30×OD260值×稀释倍数/1000。根据实际浓度，用DEPC水将RNA浓度调为1μg/μl。3、RNA逆转录为cDNA反应条件如下：RNA（1μg），1μlOligodTprimer（50μM），1μlRandom6-mers（100μM），1μlPrimeScriptTMRTEnzymeMix，4μl5×PrimeScriptTMbuffer，RNase-freedH2O，总体积20μl。反应条件为37℃15min，85℃5s，产物cDNA4℃保存。4、荧光定量PCR实验步骤实时荧光定量PCR（ABI7500，USA）检测ABCC3-013cDNA水平，采用SYBRPremixExTaqTM（TaKaRaBiotechCo.，Ltd，Dalian，China）荧光定量PCR试剂。引物设计见下表1，反应体系20μl包含：1μlcDNA样本，0.8μl上游引物（10μM），0.8μl下游引物（10μM），10μlSYBRPremixExTaqTM，0.4μlROXReferenceDye和7μldH2O。PCR循环条件：95℃本文档来自技高网...
【技术保护点】
ABCC3‑013 mRNA在制备检测氯吡格雷抵抗的试剂盒中的应用，所述ABCC3‑013 mRNA的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。
【技术特征摘要】
1.ABCC3-013mRNA在制备检测氯吡格雷抵抗的试剂盒中的应用，所述ABCC3-013mRNA的核苷酸序列如SEQIDNO.2所示。2.一种检测氯吡格雷抵抗的试剂盒，其特征在于，包括对应于ABCC3-013mRNA的特异性引物、探针、和/或芯片，所述ABCC3-013mRNA的核苷酸序列如SEQIDNO.2所示。3.如...
【专利技术属性】
技术研发人员：谢红光，柳伟强，潘玉琴，杨平，殷蒨，米琼宇，
申请(专利权)人：南京市第一医院，
类型：发明
国别省市：江苏,32
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