结晶型抗-hTNFα抗体制造技术

本发明专利技术涉及用于将抗－ｈＴＮＦα抗体结晶的分批结晶方法，其允许以工业规模制备该抗体；根据该方法获得的抗体晶体；含有所述晶体的组合物以及使用所述晶体和组合物的方法。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】结晶型抗-hTNFa抗体本专利技术涉及用于将抗-hTNFa抗体结晶的分批结晶法，其允许以工 业规模制备该抗体；根据该方法获得的抗体晶体；含有所述晶体的组 合物以及使用所述晶体和组合物的方法。技术背景 a)抗体晶体目前有超过100种单克隆抗体正处于临床研究第2期或第3期评 估，mAb市场可视为最具前景的生物医药市场之一。由于所述药物必 须以通常超过100mg的单剂量递送，因此急需发现满足稳定性、安全 性和患者顺应性的适当配制策略。然而，高度浓缩的液态mAb制剂展示增加的粘度、阻碍注射器通 过患者友好细针的能力。此外，当与中度浓缩的溶液相比时，mAb分 子在所述高浓度下的聚集趋势呈指数增加。总的，就安全性和稳定性 要求而言，其不可接受。因此，高mAb剂量的递送受限于大体积，其通常必须经由输液递 送。此给药方式成本高且显著降低患者的顺应性。因此，高度需要用于皮下注射的医药学上可应用的低体积mAb晶 体悬浮液。理论上，归因于蛋白质结构运动受阻的晶格的刚性，影响 mAb完整性的降解途径应显著减速。此外，可预期当将高度浓缩的晶 体悬浮液与液体制剂相比时粘度增加将显著降低。关于持续释放，可 能以使蛋白质晶体进入患者体内时緩慢溶解的方式产生或改造蛋白质 晶体。由于将防止损害mAb结构的赋形剂和方法广泛应用，因此此举 将为递送持续释放型制剂的极适宜方式。尽管使用蛋白质晶体作为药物具有极大潜力，但已进行少数尝试 以系统地评估此策略。一熟知实例为胰岛素，其在数十年以前已成功结晶。现今，已充 分描述胰岛素晶体悬浮液的用途，其提供已在市场上充分公认的稳定 且长效的制剂。开发胰岛素晶体与使所有其它蛋白质结晶的间的差异 可能与有序胰岛素聚集体在胰腺中天然形成的事实有关。因此，当使6胰岛素与过量锌离子接触时，胰岛素晶体易于获得。多数其它蛋白质 趋向于形成无序沉淀物而非晶体，且因此发现蛋白质的结晶条件为耗 时且不简单的任务。尽管对收集蛋白质晶体用于X射线绕射分析已产生极大关注，但 由于基本上任何蛋白质均表现不同，因此发现适当结晶条件的探索仍 为经验科学。至今，尚未发现可仅通过理性可靠地预测所选蛋白质的 成功结晶条件的通则。因此，获得给定蛋白质的晶体始终被称为稍后 无论设计任何预定应用的"瓶颈"。为使事物甚至更具挑战性，归因于分子的可挠性，抗体经描述为 尤其硬以便结晶。然而，长时间以来已知免疫球蛋白晶体的实例。150年前由英国医 师Henry Bence Jones描述免疫球蛋白晶体的第一个实例，其自骨髓瘤 患者的尿中分离出异常Ig轻链二聚体的晶体(Jones 1848)。自此，所述 异常Ig被称作Bence Jones蛋白质。1938年，来自骨髓瘤患者血清的 不同异常Ig的自发结晶得以描述(von Bonsdorf, Groth等人1938)，其 显然为Ig重链寡聚物(MW200 kDa)。在接下来的三十年里，描述具有正常结构(两个重链与两个轻链相 连接)的结晶型人类免疫球蛋白，其也主要自骨髓瘤患者(Putnam 1955) 分离。Davies和合作者最先使用X-射线晶体绕射表征称为"Dob"的 完整人类骨髓瘤抗体的结构(Terry, Matthews等人1968),且在1971 年确定其三维结构(Sarma, Silverton等人1971)。其它人继续其先行工 作,得到IgG "Kol"(Huber, Deisenhofer等人1976)、 IgG "Meg" (Rajan, Ely等人1983)和犬淋巴瘤IgG2a(Harris, Larson等人1992)的晶体结构。免疫球蛋白晶体在再溶解后保留其特殊免疫学活性。Nisonoff等人 于1968年报导易于结晶的兔抗-对-氮杂苯甲酸酯抗体"X4"。抗体X4 在结晶前以及在晶体再溶解后经广泛表征。发现-对-碘苯甲酸酯与 再溶解的X4特异性地且有效结合；再溶解的晶体也显示对未纯化兔血 清典型的多特异性Ouchterlony免疫扩散反应(Nisonoff, Zappacosta等 人1968)。 Connell和合作者描述称为"Tem，，的人类骨髓瘤？免疫球蛋 白-lK(IgG-K),其在低温下自血清自发地结晶(Connell, Freedman等人 1973)。发现Tem晶体充分形成且具有菱面体对称。含有Tem的血清经 琼脂糖免疫扩散技术广泛表征。Tem晶体的再溶解溶液的电泳和免疫扩散展示其与通过冷冻沉淀法获自血清的物质相同且与分离的骨髓瘤蛋白相同(Connell, Freedman等人1973)。Mills和合作者于1983年报导由白蛋白的人类单克隆抗体导致的 异常晶体冷球蛋白血症(Mills, Brettman等人1983)。此处，自两个患 者中分离到极相似立方形晶体。将晶体再溶解接着进行电泳和免疫电 泳指示所述晶体包含两种比率为l:2的蛋白质组份，单克隆IgG-人和人 类血清白蛋白(Jentoft, Dearborn等人1982)。通过溶解原始晶体接着进 行管柱层析以制备规模分离所述组份。尽管任一分离组份自身并不结 晶，但重组合后原始二分复合物重新形成且随后结晶。再溶解、分离 的IgG和其Fab片段与人类血清白蛋白的独特沉淀特征和免疫学反应 性的深入研究指示两个再溶解、分离的组份的重新締合在性质上具有 免疫性，亦即结晶型抗体再溶解后仍具有其原生的高度特异性(对于人 类血清白蛋白)结合特征(Mills, Brettman等人l983)。近来，Margolin和合作者报导结晶型抗体的潜在治疗用途(Yang, Shenoy等人2003)。其发现治疗性单克隆抗体曲妥珠单抗 (trastuzumab)(Herceptin⑧)可结晶(Shenoy, Govardhan等人2002)。结晶 型曲妥珠单抗悬浮液在小鼠肿瘤模型中具有治疗功效，因此证明结晶 型曲妥珠单抗保留其生物活性(Yang, Shenoy等人2003)。b)结晶技术不同于某些其它科学或工程学努力，各种蛋白质的结晶不能使用 确定的方法或算法成功进行。当然，如世界著名蛋白质结晶专家A. McPherson所解释，在最近20-30年间存在极大技术进步。McPherson 提供关于大分子结晶的策略、对策、试剂和装置的广泛细节。然而其功期望值结晶的方法。McPherson说明(例如)"无论任何程序必须投 入精力改善并优化系统(包括溶剂与溶质两者)的参数，以促使且促进^ 子的间的特异性结合相互作用且使其形成后稳定。问题的此后一方面 通常依赖于所结晶的特定蛋白质或核酸的特定化学和物理特性" (McPherson 1999,第159页)。蛋白质结晶领域技术人员广泛公认不存在获得所关注的新蛋白 质、应用确定加工步骤且由此获得所需晶体的算法。数种市售筛选系统(例如Hampton 1和2、 Wizzard I和II)允许以微 升规模筛选特定蛋白质的潜在适当结晶条件。然而，该筛选系统获得 的阳性结果未必允许以较大、工业上可应用的批次规模成功结晶。微 升尺度的结晶试验向工业尺度的转化经描述为具有挑战性的任务(参见 Jen等人，2001)。Baldock等人(1996)报导微批次与汽相扩散用于初始筛选结晶条件 的比较。使用一组结晶溶液筛选六种本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种用于将抗－ｈＴＮＦα抗体结晶的分批结晶方法，其包含以下步骤：　（ａ）提供所述抗体与作为结晶剂的无机磷酸盐混合的水溶液；和　（ｂ）培育所述含水结晶混合物直至形成所述抗体的晶体。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】...

【专利技术属性】
技术研发人员：DW包赫尼，W佛路荷夫，HJ克鲁斯，A柯尼格斯多佛，G温特，S高特斯乔克，
申请(专利权)人：艾博特生物技术有限公司，
类型：发明
国别省市：BM[百慕大]