一种对CYP3A5*3位点进行基因型检测的方法和试剂盒技术

一种对CYP3A5*3位点进行基因型检测的方法和试剂盒，本发明专利技术涉及分子生物学和医学领域，本发明专利技术针对使用他克莫司、环孢素剂量相关不良反应风险相关的基因SNP位点设计特异引物、探针以及写到相关报告探针的磁珠，可分型检测SNP位点的型别。本发明专利技术提供的检测试剂盒可以灵敏、快速低检测人全血样本中CYP3A5*3(G>A)型别，可为患者使用他克莫司、环孢素剂量调整提供可靠的实验证据，减少不良反应发生，指导临床治疗。

A method and kit for genotyping of CYP3A5*3 sites

A method and kit for genotyping of CYP3A5*3 loci. The present invention relates to the field of molecular biology and medicine. The present invention designs specific primers, probes, and magnetic beads written to related report probes for the SNP loci related to the risk related to the dose related adverse reaction of tacrolimus and cyclosporin. The type of the SNP site. The detection kit provided by the present invention can detect CYP3A5*3 (G>A) types in human blood samples sensitively and quickly, providing reliable experimental evidence for the use of tacrolimus and cyclosporin dose adjustment, reducing the occurrence of adverse reactions and guiding clinical treatment.

【技术实现步骤摘要】
一种对CYP3A5*3位点进行基因型检测的方法和试剂盒
本专利技术涉及分子生物学和医学领域，更具体的，本专利技术涉及他克莫司、环孢素不良反应风险相关SNP位点的试剂盒，通过检测他克莫司、环孢素不良反应相关的细胞色素氧化酶CYP3A5*3基因的单核苷酸多态性位点(SNP)基因型来评估他克莫司、环孢素在应用过程中不良反应及剂量调整。
技术介绍
细胞色素P4503A(CytochromeP4503A，CYP3A)是体内最主要的CYP450酶，占成人肝脏CYP450酶总量的25％，也是肠道中重要的CYP酶，主要由CYP3A4、CYP3A5、CYP3A7和CYP3A43组成，其中CYP3A4和CYP3A5尤其重要。CYP3A4和CYP3A5催化完成60％以上临床常用药物的氧化反应。CYP3A基因表达存在明显的个体差异。在成人，通常CYP3A4的浓度明显高于CYP3A5，但在部分人群，CYP3A5为主要表达的CYP3A酶。以往的研究中表明，中国汉族健康人群中CYP3A活性的个体差异可达到13倍，目前认为CYP3A活性的个体差异可能是造成其代谢底物药代动力学不同的主要原因之一。迄今为止，在CYP3A4已经确定的39个等位基因中，绝大多数CYP3A4的单核苷酸多态性(SNP)不会导致酶活性的改变，仅CYP3A4*18A(878T>C)点突变可引起酶活性的升高，但在中国人群中的发生率仅为1％左右。而CYP3A5的多数SNPs可引起蛋白表达的剪接缺陷，明显降低CYP3A5的活性。其中CYP3A5*3在intron3(6986A>G)的突变引起剪接缺失，从而使得突变型纯合子个体，即其携带基因为CYP3A5*3/*3的人不表达CYP3A5，导致在肝脏或小肠CYP3A5蛋白酶活性严重降低或缺失，由此可能会使其代谢底物清除率下降，血浆药物浓度升高。CYP3A5*3在中国人、日本人、韩国人、南亚人、黑种人、白种人及西班牙人中的发生频率为71％～76％，71％～85％，70％，59％～61％，27％～55％，84％～95％和62％～83％。由于基因多态性所造成的活性差异使CYP3A5及其相关的研究成为目前的热点之一。环孢素(CyclosporineA，CsA)是含有11个氨基酸的中性环状多肽，属钙调磷酸酶抑制剂家族，在临床上作为预防实体器官移植和骨髓排斥反应的免疫抑制剂得到广泛应用。口服吸收不规则，且对不同个体的差异较大，吸收后主要与脂蛋白结合，与血浆蛋白的结合率可高达约90％。成人的血浆T12约为19h，而儿童仅为7h。CsA仅有6％经肾脏排泄，其中约01％仍以原形排出，其他由肝脏CYP3A4和CYP3A5进行代谢成超过20种以上的代谢产物，代谢产物经胆道排泄至粪便中排出。CYP3A4代谢形成的初级代谢产物主要为AM1，AM9和AM4N，而CYP3A5只形成AM9，但在人体内各代谢途径可以相互转换，不存在单一代谢途径。临床上，CsA血药浓度过低则达不到预期的免疫抑制效果而引发急性排斥反应，过高则可以引起许多严重不良反应，如肝、肾功能损害等。因其具有治疗指数窄，个体间药代动力学差异较大的特点，临床上定期对应用环孢素病人进行血药浓度的检测已经成为常规。随着对药物基因组学研究的深入，目前认为CsA药物代谢酶CYP3A5的差异可能是其形成个体差异的主要原因。他克莫司于1994年被FDA批准为肝移植的抗注射药物。它是一种大环内酯，其在T淋巴细胞中结合细胞质蛋白受体FK结合蛋白12(FKBP-12)。该复合物结合钙调神经磷酸酶，阻止活化的T细胞核因子的去磷酸化和核易位，最终抑制IL-2产生和T淋巴细胞活化。如今，他克莫司是实体器官移植及风湿病治疗中广泛应用的免疫抑制药物之一。其临床使用由于其药代动力学之间的高度变异性及其狭窄的治疗指数而复杂化。CYP3A5基因具有多个SNP，CYP3A5在中国人的突变率为71％～76％，其中CYP3A5在内含子3的6986位点SNP(A＞G)起主要作用。根据CYP3A5多态性的命名原则，CYP3A5的6986位点SNP的野生纯合型(AA)命名为CYP3A5*1/*1，突变纯合型(GG)命名为CYP3A5*3/*3，杂合型命名为CYP3A5*1/*3。由于6986位点SNP(A＞G)的存在，mRNA剪切位点发生改变，产生了一个终止密码子，翻译提前终止，产物为一个截断蛋白质；从而使得突变型纯合子个体CYP3A5*3/*3基因型者不能表达有酶活性CYP3A5蛋白质，为慢FK506代谢型，使CYP3A5*3/*3患者与CYP3A5*1/*1和CYP3A5*1/*3患者的药代动力学显著不同。目前关于CYP3A5基因的研究主要集中在临床肾移植。有学者在肾移植受体中发现，CYP3A5非表达型患者口服FK506清除率的加权平均值比表达型低48％，并据此希望通过肾移植受体CYP3A5等的基因分型来优化术后免疫抑制剂的个体化治疗。而且有研究，发现超过70％的肾移植患者因此受益。因此，对CYP3A5基因进行SNP位点检测，有助于对应用环孢素、他克莫司药物治疗的患者进行剂量调整，减少不良反应发生，进行个体化治疗。
技术实现思路
本专利技术针对使用他克莫司、环孢素剂量相关不良反应风险相关的基因SNP位点设计特异引物、探针以及写到相关报告探针的磁珠，可分型检测SNP位点的型别。本专利技术提供的检测试剂盒可以灵敏、快速低检测人全血样本中CYP3A5*3(G>A)型别，可为患者使用他克莫司、环孢素剂量调整提供可靠的实验证据，减少不良反应发生，指导临床治疗。一种对CYP3A5*3位点进行基因型检测的试剂盒，所述的试剂盒包括如下序列的引物：所述的试剂盒包括如下序列的特异探针：所述的试剂盒还包括如下序列的报告探针：TATCTCTTCCCTGTTTGGAC。一种对CYP3A5*3位点进行基因型检测的方法，所述的方法包括如下步骤：首先进行PCR反应，实现扩增；再进行多重OLA反应，标记和连接；然后进行杂交反应，最后进行基因型的分析。进一步的，PCR反应体系如下：2xqiagenHotstarMM5ul,primermix1ul，DNA样本2ul，灭菌水2ul；反应条件为95℃、15min，进行30个循环的94℃,30秒，60℃,30秒，72℃,30秒；72℃、7分钟，4℃维持。进一步的，多重OLA反应如下：配制2xOLAmastermix，将OLAmastermix与PCR反应产物混合，混匀后进行连接反应。进一步的，配制2xOLAmastermix包括有：10xTaqLigasebuffer2ul,40000U/ml的TaqDNALigase0.25ul，野生型探针mix1ul,突变型探针mix2ul，去离子水4.75ul。进一步的，连接反应条件如下：96℃2min,30个循环的94℃15s,37℃1min；4℃维持。进一步的，杂交反应程序如下：选择相应报告探针磁珠，并重悬，将磁珠混合，并稀释最多至100u颗/ul，用2XTmhybridizationbuffer，混合后加入磁珠混合物至每孔中，添加1-5ulOLAreaction和25uldH2O至每个孔，进行PCR反应：96℃90s，37℃30min，吸走上清，本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种对CYP3A5*3位点进行基因型检测的试剂盒，其特征在于，所述的试剂盒包括如下序列的引物：

【技术特征摘要】
1.一种对CYP3A5*3位点进行基因型检测的试剂盒，其特征在于，所述的试剂盒包括如下序列的引物：2.如权利要求1所述的一种对CYP3A5*3位点进行基因型检测的试剂盒，其特征在于，所述的试剂盒包括如下序列的特异探针：3.如权利要求1所述的一种对CYP3A5*3位点进行基因型检测的试剂盒，其特征在于，所述的试剂盒还包括如下序列的报告探针：tatctcttccctgtttggac。4.一种对CYP3A5*3位点进行基因型检测的方法，其特征在于，所述的方法包括如下步骤：首先进行PCR反应，实现扩增；再进行多重OLA反应，标记和连接；然后进行杂交反应，最后进行基因型的分析。5.如权利要求4所述的一种对CYP3A5*3位点进行基因型检测的方法，其特征在于，PCR反应体系如下：2xqiagenHotstarMM5ul,primermix1ul，DNA样本2ul，灭菌水2ul；反应条件为95℃、15min，进行30个循环的94℃,30秒，60℃,30秒，72℃,30秒；72℃、7分钟，4℃维持。6.如权利要求4所述的一种对CYP3A5*3位点进行基因型检测的方法，其特征在于，多重OLA反应如下：配制2xOLAmastermix，将OLAmastermix与PCR反应产物混合，混匀后进行连接反应。7.如权利要求6所述的一种对CYP3A5*3位点进行基因型检测的方法，其特征在于，配制2xOLAmastermix包括有：10xTaqLigasebuffer2ul,40000U/ml的TaqDNALigase0.25ul，野生型探针mix1ul,突变型探针mix2ul，去离子水4.75ul...

【专利技术属性】
技术研发人员：杜予和，
申请(专利权)人：广州和康医疗技术有限公司，
类型：发明
国别省市：广东,44