一种检测IL28基因位点的方法及试剂盒技术

一种检测IL28基因位点的方法及试剂盒，本发明专利技术涉及分子生物学和医学领域，为提供一种更为精准的IL28基因型检测的试剂盒和方法，本发明专利技术提供了一种特异引物、特异探针序列和报告序列。采用该特异引物和探针制备的试剂盒可以灵敏、快速低检测人全血样本中疗效相关SNP型别，可为干扰素用药疗效预测提供可靠的实验证据，指导临床治疗选择。

【技术实现步骤摘要】
一种检测IL28基因位点的方法及试剂盒
本专利技术涉及分子生物学和医学领域，更具体的，本专利技术涉及一种干扰素药物疗效SNP位点的试剂盒，通过同时检测干扰素药物疗效相关的IL28基因的单核苷酸多态性位点(SNP)基因型来评估干扰素在丙型肝炎患者及其他疾病使用中的疗效。
技术介绍
丙型肝炎(hepatitisC)作为一种世界范围内广泛流行的传染性疾病，其主要传播方式为血液传播，此外针刺、吸毒等也是其常见的感染途径。感染丙型肝炎病毒后大多数患者逐渐发展至慢性丙型肝炎，若不能得到正规有效的治疗干预，约1/3的慢性丙型肝炎患者将最终进展至肝硬化、肝功能衰竭等晚期病变。多年来，干扰素联合利巴韦林(PR)的治疗方式一直是治疗丙型肝炎的标准方案(standardofcare，SOC)。目前的诸多研究提示，丙型病毒性肝炎预后转归、接受抗病毒治疗的疗效与宿主IL-28B基因多态性、HCV基因型、基线病毒RNA水平(baselineviralload)和肝纤维化程度等密切相关。Ge等首先报道了IL-28B基因与丙型肝炎感染者预后的相关性，在对不同人种丙型肝炎患者进行基因检测后发现：IL-28B基因单核苷酸多态性位点rs12979860与持续病毒学应答显著相关，IL-28Brsl2979860位点其基因表型有C/C，C/T和T/T，其中C/C为保护性基因型。rsl2979860与病毒学应答有较强的关联性，其中C/C基因型与患者是否获得持续病毒学应答率高度相关。在接受标准治疗方案治疗过程中，携带C/C基因型的患者可获得更高的持续病毒学应答率，大概是其他基因型的2～3倍。同时，C/C基因型分布具有明显的种族差异，在非HCV感染者中，C/C基因型在黄色人种中占比最高，90％以上。rs12979860C/C型比例越高，慢性丙型肝炎患者的病毒自发清除率越高，rs12979860基因型与未获得快速病毒学应答的丙型肝炎患者的持续病毒学应答率相关，C/C型与T/T型持续病毒学应答率分别为87％和29％。而对IL-28B基因型的检测和引物以及对应的特异探针和报告探针有着很大的关系。
技术实现思路
为提供一种能精准检测IL-28基因型的试剂盒，本专利技术提供了一种特异引物、特异探针序列和报告序列。本专利技术提供的技术方案如下：一种检测IL28基因位点的试剂盒，其特征在于，所述的试剂盒包括有如下序列的引物：优选的，所述的试剂盒还包括特异探针，所述的特异探针序列如下：优选的，所述的试剂盒还包括报告探针，所述的报告探针序列如下：报告探针1GAACCAGGGTTGAATTGCAC是IL28B的磁珠的报告探针一种检测IL28B基因位点的方法，所述的方法包括如下的步骤：首先进行PCR反应，实现扩增；再进行OLA反应，标记和连接；然后进行杂交反应，最后进行基因型的分析。优选的，所述的PCR反应体系如下：2xqiagenHotstarMM5ul,primermix1ul，DNA样本2ul,灭菌水2ul；PCR反应条件为95℃、15min，进行30个循环的94℃,30秒，60℃,30秒，72℃,30秒；72℃、7分钟，4℃维持。优选的，所述的OLA反应如下：配制2xOLAmastermix，将OLAmastermix与PCR反应产物混合，混匀后进行连接反应。优选的，配制2xOLAmastermix包括有：10xTaqLigasebuffer2ul,40000U/ml的TaqDNALigase0.25ul，野生型探针mix1ul，突变型探针mix2ul，去离子水4.75ul。优选的，连接反应条件如下：96℃2min,30个循环的94℃15s,37℃1min；4℃维持。优选的，杂交反应的洗涤程序过程如下：选择报告探针的磁珠，重悬，然后稀释最多至100u颗/ul，用2XTmhybridizationbuffer，混合后加入磁珠至每孔中，添加1-5ulOLAreaction和25uldH2O至每个孔，进行PCR反应：96℃90s,37℃30min，吸走上清，用1xTmhybridizationbuffer重悬磁珠，吸磁30-60s，再次吸走上清，重复用1xTmhybridizationbuffer重悬磁珠，吸磁30-60s，第三次吸走上清，用1xTmhybridizationbuffer重悬磁珠，在37℃温育15min，加入50ul反应产物至LUMINEX中分析。优选的，杂交反应的不洗涤过程如下：1、选择磁珠，并重悬；2、将磁珠稀释至100u颗/ul，用2XTmhybridizationbuffer，振荡混合；3、加入磁珠混合物至每孔中；4、添加样品至每孔中；5、进行PCR反应：96℃90s，37℃30min；6、准备6ug/mlSAPE在1xhybridizationbuffer；7、添加100ulSAPEmix，混匀；8、37℃温育15min；9、加入100ul至37℃的luminex中分析。本专利技术针对丙型肝炎病毒感染患者及其他疾病患者使用干扰素药物疗效相关的SNP位点设计特异引物和探针，可分型检测该SNP位点的型别。采用上述特异引物和探针制备的试剂盒可以灵敏、快速低检测人全血样本中疗效相关SNP型别，可为干扰素用药疗效预测提供可靠的实验证据，指导临床治疗选择。具体实施方式一种试剂盒，该试剂盒对人类基因组DNA中来干扰素药物疗效的基因位点，即IL28即rs12979860。设计特异性引物和野生型/突变型探针，与偶联相应报告探针的MagPlex-TAG磁珠进行杂交反应，通过显色反应在luminex200仪器上进行检测。通过对信号值的读取判读各个SNP位点的碱基型别进行判定，其中特异引物序列如下：特异探针序列如下：报告探针序列如下：反应过程如下：在PCR反应管进行PCR反应，反应的体系为总体积10μl，包含2xqiagenHotstarMM5ul,primermix1ul，DNA样本2ul,灭菌水2ul。在ABI9700型PCR扩增仪上进行反应，反应条件为95℃、15min，进行30个循环的94℃,30秒，60℃,30秒，72℃,30秒；72℃、7分钟，4℃维持。OLA反应：配制2xOLAmastermix：10xTaqLigasebuffer2ul,TaqDNALigase(40,000U/ml)0.25ul，野生型探针mix(100nMeach)1ul,突变型探针mix(2.5uMeach)2ul，去离子水4.75ul。将OLAmastermix与反应产物混合：2xOLAmastermix10ul,扩增的PCR产物5ul,灭菌去离子水5ul。上下吹打混匀，盖上反应管，进行在ABI9700型PCR扩增仪上连接反应。96℃2min,30个循环的94℃15s,37℃1min；4℃维持。杂交反应：选择相应报告探针的MagPlex-TAG磁珠，并重悬。将每种磁珠混合，并稀释至100u颗/ul，用2XTmhybridizationbuffer，振荡混合20s。加入25ul磁珠混合物至每孔中。(应该提供2500颗珠子/每种反应)。添加1-5ulOLAreaction和25uldH2O至每个孔。调整H2O的体积，使总体积接近50ul。盖上盖子，进行PCR反应：96℃90s,37℃30m本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种检测IL28基因位点的试剂盒，其特征在于，所述的试剂盒包括有如下序列的引物：

【技术特征摘要】
1.一种检测IL28基因位点的试剂盒，其特征在于，所述的试剂盒包括有如下序列的引物：2.如权利要求1所述的检测IL28基因位点的试剂盒，其特征在于，所述的试剂盒还包括特异探针，所述的特异探针序列如下：3.如权利要求1所述的检测IL28基因位点的试剂盒，其特征在于，所述的试剂盒还包括报告探针，所述的报告探针序列如下：报告探针1GAACCAGGGTTGAATTGCACIL28B的磁珠的报告探针4.一种检测IL28基因位点的方法，其特征在于，所述的方法包括如下的步骤：首先进行PCR反应，实现扩增；再进行OLA反应，标记和连接；然后进行杂交反应，最后进行基因型的分析。5.如权利要求4所述的检测IL28基因位点的方法，其特征在于，所述的PCR反应体系如下：2xqiagenHotstarMM5ul,primermix1ul，DNA样本2ul,灭菌水2ul；PCR反应条件为95℃、15min，进行30个循环的94℃,30秒，60℃,30秒，72℃,30秒；72℃、7分钟，4℃维持。6.如权利要求4所述的检测IL28B基因位点的方法，其特征在于，所述的OLA反应如下：配制2xOLAmastermix，将OLAmastermix与PCR反应产物混合，混匀后进行连接反应。7.如权利要求6所述的检测IL28基因位点的方法，其特征在于，配制2xOLAmastermix包括有：10xTaqLigasebuffer2ul,40000U/ml的TaqDNALigase0.25ul，野生型探针mix1ul，突变型探针mix2ul，去离子水4.75ul。8....

【专利技术属性】
技术研发人员：杜予和，
申请(专利权)人：广州和康医疗技术有限公司，
类型：发明
国别省市：广东,44