基于多重PCR捕获技术的杜氏/贝氏肌营养不良症的检测试剂盒及方法技术

本发明专利技术公开了一种DMD基因多重PCR捕获引物组、DMD基因突变检测试剂盒及DMD基因突变检测方法。发明专利技术人针对DMD基因的79个外显子和两侧50bp内含子序列以及23个已知内含子致病突变提供了一种多重PCR捕获引物，并且基于引物组提供了一种DMD基因突变检测方法，其检测灵敏度高，准确性好，扩增效率高度一致，对DNA样本质量要求低，解决了现有技术难以采用多重PCR捕获技术一次性进行完整的DMD基因突变信息检测，特别是对于杂合性缺失/重复。

【技术实现步骤摘要】
基于多重PCR捕获技术的杜氏/贝氏肌营养不良症的检测试剂盒及方法
本专利技术属于基因测序领域，具体而言，涉及一种基于多重PCR目标序列捕获技术的杜氏/贝氏肌营养不良症的检测试剂盒及方法。
技术介绍
杜氏/贝氏肌营养不良症是致死性X连锁隐性遗传病，根据进展程度不同可分为假肥大型肌营养不良症(Duchennemusculardystrophy,DMD)即杜氏营养不良症和贝氏肌营养不良症(Beckermusculardystrophy,BMD)，两者互为等位基因临床异质性疾病。其中DMD的主要临床特征表现为进行性四肢近端骨骼肌萎缩无力、小腿腓肠肌假性肥大，同时累及呼吸肌和心肌，部分患者伴有智力障碍，患者从3-5岁起病，12岁左右失去行走能力，20多岁死亡，其在活产男婴中的发病率高达1/3500。与DMD相比，BMD发病年龄比DMD晚，进展速度慢，其发病率有报道为1/30000。总之，目前国内外尚缺乏对DMD/BMD特效的治疗方法，故只能通过对先证者的确诊和携带者筛查，然后进行专业的遗传咨询、婚育指导和产前诊断来杜绝DMD/BMD患儿的出生。与DMD/BMD致病相关的编码抗肌萎缩蛋白(dystrophin)的DMD基因定位于Xp21.2-21.3。大约有60-65％的DMD患儿是由于DMD基因外显子缺失所致，5-10％是由于DMD基因外显子重复所致，其余约30％是由于DMD基因微小突变导致。由于DMD基因的复杂性和突变类型的多样性，传统的DMD基因的突变检测方法如Southern杂交法(Southernblotting)、变性高效液相色谱法(Denaturinghighperformanceliquidchromatography，DHPLC)、多重连接依赖式探针扩增法(Multiplexligation-dependentprobeamplification，MLPA)、微阵列-比较基因组杂交法(arraycomparativegenomichybridization，arrayCGH)等，均存在一些突出问题如只能检出部分突变类型和已知突变，检测通量低，检测周期长，而且检测准确率低；约30％患儿需要进行二次检测，大大增加了检测周期和检测成本。随着新一代高通量目标序列捕获测序技术的发展，以LifeTechnologies公司IonPGMTM/ProtonTM系列和Illumina公司的Hiseq和Miseq系列测序仪为代表，有着其他技术无可替代的高通量、低成本、检测变异类型全面和准确率高等优势，已被广泛的应用于各类生物学研究和医学检测。相比于探针捕获技术，应用多重PCR扩增进行目标序列捕获具有操作简单、成本低，短时间大量富集目标DNA序列等显著优势，大大缩短了检测流程和检测时间。因此，开发一种基于多重PCR捕获技术，并可快速、准确、一次性检测DMD基因所有突变(纯合/杂合性缺失、重复、点突变)的产品和方法，非常具有市场应用价值。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种DMD基因多重PCR捕获引物组、DMD基因突变检测试剂盒及DMD基因突变检测方法。本专利技术所采取的技术方案是：DMD基因多重PCR捕获引物组，所述引物组含有核苷酸序列如SEQIDNO:1～SEQIDNO:290所示的引物序列。作为上述引物组的优选，所述引物组还含有捕获内参基因的引物序列。作为上述引物组的优选，所述引物序列5’端还连接有测序平台建库所需的序列。作为上述引物组的优选，内参基因选自GAPDH基因、β-actin基因、18s-rRNA基因。DMD基因突变检测试剂盒，包括上述任一项所述的DMD基因多重PCR捕获引物组。DMD基因突变检测方法，包括：根据测序平台建库需求，利用上述引物组构建扩增子文库，经文库质控、高通量测序和生物信息分析，获得DMD基因的突变信息，所述突变信息包括纯合性/杂合性的缺失/重复、点突变和未知突变。作为上述方法的优选，所述方法进一步包括步骤：(1)在引物序列5’端连接上通用序列作为引物组，用于捕获模板DNA的目标区域，获得多重PCR产物，对多重PCR产物进行纯化；(2)利用P1接头、标签接头与多重PCR纯化产物进行第二次PCR扩增，对不同样品的第二次扩增产物进行混合和纯化，获得扩增子文库；(3)扩增子文库质控、proton测序，对下机数据进行生物信息学分析。作为上述方法的优选，引物混合比例按表1的引物pooling系数所示。作为上述方法的优选，任选地，步骤(1)中，10μL多重PCR的反应体系为：2X多重PCR缓冲液5μL、10Xprimerpool(100uM)0.5μL、Nuclease-freeWater(4.5-Y)μL、gDNA(10ng)YμL；PCR反应程序：95℃3～5min；12～15cycles(95℃30～45s，62℃1～3min，72℃30～45s)，72℃1～2min，8～16℃Hold；任选地，步骤(2)中，25μL的第二次PCR扩增体系：2X建库PCR缓冲液12.5μL、标签接头0.5μL、P1接头0.5μL、多重PCR纯化产物11.5μL；PCR反应程序：98℃3～5min；23～26cycles(98℃10～20s，60℃30s～2min，72℃20～40s)，72℃1～2min，8～16℃Hold。作为上述方法的优选，所述通用序列的核苷酸序列为：5’-AAATGGGCGGTAGGCTTG-3’；所述P1接头：5’-CCTCTCTATGGGCAGTCGGTGAT-通用序列-3'；标签接头：5’-CCATCTCATCCCTGCGTGTCTCCGACTCAGNNNNNNNNGAT-通用序列-3’；序列中N表示AGCT任意碱基，NNNNNNNN用于识别不同样品构建的文库。本专利技术的有益效果是：专利技术人针对DMD基因的79个外显子和两侧50bp内含子序列以及23个已知内含子致病突变提供了一种多重PCR捕获引物，并且基于引物组提供了一种DMD基因突变检测方法，其检测灵敏度高，准确性好，扩增效率高度一致，对DNA样本质量要求低，解决了现有技术难以采用多重PCR捕获技术一次性进行完整的DMD基因突变信息检测，特别是对于杂合性缺失/重复。附图说明图1是实施例1混合DNA文库经Agilent2100生物分析仪检测结果；图2是9号样品深度分析图，referencedepth为阴性样本参考深度；图3是4号样品深度分析图，referencedepth为阴性样本参考深度。具体实施方式DMD基因多重PCR捕获引物组，所述引物组含有核苷酸序列如SEQIDNO:1～SEQIDNO:290所示的引物序列。作为上述引物组的优选，所述引物组还含有捕获内参基因的引物序列。其中，内参基因的作用在于排除样品间建库误差，进行生物信息分析时可以基于内参基因进行归一化处理，从而提高CNV检测的准确性，内参基因可选自选自GAPDH基因、β-actin基因、18s-rRNA基因，内参基因的捕获引物至少一对，作为优选的，至少三对。作为上述引物组的优选，所述引物序列5’端还连接有测序平台建库所需的序列，在引物5’端适应性地连接测序平台建库所需的序列，如接头、标签、通用序列等，以满足二代测序的要求，二代测序平台包括但不限于IonTorren本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.DMD基因多重PCR捕获引物组，所述引物组含有核苷酸序列如SEQ ID NO:1～SEQ ID NO:290所示的引物序列。

【技术特征摘要】
1.DMD基因多重PCR捕获引物组，所述引物组含有核苷酸序列如SEQIDNO:1～SEQIDNO:290所示的引物序列。2.根据权利要求1所述的DMD基因多重PCR捕获引物组，其特征在于：所述引物组还含有捕获内参基因的引物序列。3.根据权利要求1或2所述的DMD基因多重PCR捕获引物组，其特征在于：所述引物序列5’端还连接有测序平台建库所需的序列。4.根据权利要求2所述的DMD基因多重PCR捕获引物组，其特征在于：内参基因选自GAPDH基因、β-actin基因、18s-rRNA基因。5.DMD基因突变检测试剂盒，包括权利要求1～4任一项所述的DMD基因多重PCR捕获引物组。6.DMD基因突变检测方法，包括：根据测序平台建库需求，利用权利要求1～4任一项所述的引物组构建扩增子文库，经文库质控、高通量测序和生物信息分析，获得DMD基因的突变信息，所述突变信息包括纯合性/杂合性的缺失/重复、点突变和未知突变。7.根据权利要求6所述的DMD基因突变检测方法，其特征在于：所述方法进一步包括步骤：(1)在权利要求1或2所述的引物序列5’端连接上通用序列作为引物组，用于捕获模板DNA的目标区域，获得多重PCR产物，对多重PCR产物进行纯化；(2)利用P1接头、标签接头与多重PCR纯化产物进行第二次PCR扩增，对不同样品的第二次扩增产物进行混合和纯化，获得扩增子文库，；(3)扩增子文库质控、proton测序，对下机数据进行生物信息学分析。8.根据权利要求7所述...

【专利技术属性】
技术研发人员：糜庆丰，周幸芝，吕来灰，吴春求，朱鹏远，黄铨飞，王杨，陈雨，刘丽菲，
申请(专利权)人：东莞博奥木华基因科技有限公司，
类型：发明
国别省市：广东,44