一种用于miRNA定量的改进型通用茎环引物及其定量方法技术

本发明专利技术公开了一种用于miRNA定量的改进型通用茎环引物，其核苷酸序列是由如SEQ ID NO：1所示的碱基序列与8个简并碱基组成，使用该茎环引物能进行序列不同的miRNA的反转录，其中8个简并碱基代表8个简并碱基代表：(A/C/G/T)(A/C/G/T)(A/C/G/T)(A/C/G/T)(A/C/G/T)(A/C/G/T)(A/C/G/T)(A/C/G/T)，使用该茎环引物能进行序列不同的miRNA的反转录。该茎环引物反转录效率高，荧光定量结果准确。还公开了采用上述茎环引物进行miRNA定量的方法。 1

【技术实现步骤摘要】
一种用于miRNA定量的改进型通用茎环引物及其定量方法
本专利技术属于miRNA定量
，具体涉及一种用于miRNA定量的改进型通用茎环引物及其定量方法。
技术介绍
miRNA是一段长度约为22nt的单链非编码RNA短核苷酸片段，在生物体内扮演着重要的角色，主要结合到3’-UTR区域干扰基因的表达进而达到调控细胞的增殖，凋亡，分化及参与疾病的发生发展，包括肿瘤、自身免疫性疾病等。因此，miRNA的表达情况分析是科学研究和临床检测中常用的技术手段。然而由于其序列长度太短，常规的荧光定量方法难以实现miRNA的定量，需要使用特定的策略方能进行定量分析。用来定量miRNA的方法有miRNA芯片技术，核酸杂交，基于TaqMan的荧光定量分析等，这几种方法虽然有利地推动miRNA相关研究的发展，但是其高昂的成本也是一般科研团队难以承受的，尤其是在一些研究刚刚起步，靶标miRNA还未确定的情况下，这些方法不仅费力，而且费钱。基于SYBR的荧光定量PCR法是一种既能提供可靠性又能降低实验成本的miRNA定量技术。反转录是miRNA的定量第一步，通常情况下需要使用一个长的茎环引物来实现miRNA的反转录，之后再像普通的基因定量一样进行荧光定量PCR。传统的特异性茎环引物的优点在于能够精确地、灵敏地检测目的miRNA的表达情况。但是，需要针对每条miRNA设计一种茎环引物，才能进行后续的定量分析。通用型茎环引物，既可以把样品中全部的miRNA转录出来，又可以通过后续的特异性荧光定量引物进行目标miRNA的定量分析，具有高效和低成本的优点，特别适合miRNA的筛选。然而，目前报道的一些通用型茎环引物存在反转录效率不高的缺点，对于一些低表达量的miRNA则有可能得不到可靠的分析结果，影响了通用型茎环引物的应用，因此有必要对通用型茎环引物进行重新设计，提高miRNA的反转录效率和荧光定量结果的准确性。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种用于miRNA定量的改进型通用茎环引物，该茎环引物反转录效率高，荧光定量结果准确。本专利技术的目的还在于提供采用上述茎环引物进行miRNA定量的方法，该方法成本低、效率高。本专利技术的上述第一个目的是通过如下技术方案实现的：一种用于miRNA定量的改进型通用茎环引物，其核苷酸序列是由如SEQIDNO：1所示的碱基序列与8个简并碱基组成，使用该茎环引物能进行序列不同的miRNA的反转录，其中8个简并碱基代表：(A/C/G/T)(A/C/G/T)(A/C/G/T)(A/C/G/T)(A/C/G/T)(A/C/G/T)(A/C/G/T)(A/C/G/T)。所述的茎环引物的5’端是由36个碱基构成的茎环结构，使用该茎环引物能进行序列不同的miRNA的反转录，3’端是由8个简并碱基构成。本专利技术中的改进型通用茎环引物，与之前报道的常规的通用型茎环引物相比较，其茎环结构发生了改变，该茎环引物的碱基序列具体为：5’-CTCAACTGGTGTCGTGGAGTCGGCAATTCAGTTGAG(SEQIDNO：1所示)+8个简并碱基-3’。采用本专利技术中的改进型通用茎环引物，能够对序列不同的miRNA使用同一种改进型通用茎环引物(也可以成为反转录引物，以下称RT引物)进行反转录。由于采用本专利技术中的改进型通用茎环引物，能够对由miRNA反转录成的cDNA，使用类似的退火温度进行荧光定量反应(以下称qPCR)，从而获得miRNA的定量结果。为了设计该茎环引物，本申请专利技术人首先获得了一个高效的通用型茎环引物，此引物可以对不同序列的miRNA进行反转录反应，避免传统方法需要对每一个miRNA设计一个茎环引物的缺陷，直接降低了引物合成成本。由于可以同时对多个miRNA进行反转录反应，使用本专利技术提供的茎环引物可以节约加样时间，降低了实验操作出错的几率。其次，本申请专利技术人对提高了通用型茎环引物的反转录和荧光定量(RT-qPCR)的反应效率，与已报道的通用型RT引物相比，本专利技术提供的通用型茎环引物可不同程度的降低miRNART-qPCR反应的Ct值，降低的Ct和miRNA的序列和结构等信息有关。本专利技术的上述第二个目的是通过以下技术方案来实现的：采用上述的茎环引物进行miRNA定量的方法，包括以下步骤：对不同的miRNA采用上述的茎环引物进行反转录，获得cDNA，然后采用qPCR引物进行qPCR反应，获得miRNA的定量结果。其中：所述的qPCR的引物包括正向引物和反向引物，所述的正向引物序列由两部分组成，一部分是由和miRNA序列反向互补的特异性碱基组成，另一部分由非特异性碱基组成；所述的反向引物是通用的核苷酸序列，具体为茎环引物上的18～35个核苷酸序列。进一步的，qPCR扩增时，本专利技术所述的正向引物由3～10特异性碱基和4～6个非特异性碱基构成，目的是调节引物的Tm值和GC含量，反向引物是由18～28个特异性碱基构成，其设计原则依赖于miRNA序列和茎环引物序列。具体的，本专利技术所述的正向引物由5～8个随机碱基和18个与miRNA互补的碱基构成，所述的反向引物的碱基序列如SEQIDNO：2所示。本专利技术提供的改进型通用茎环引物进行qPCR反应时，qPCR反应的引物设计原则，使不同miRNA的qPCR引物具有固定的Tm值，可同时进行多个miRNA的qPCR反应。本专利技术对常规的通用型茎环引物RT4以及本专利技术中的改进型通用型茎环引物RT5的RT-qPCR反应的效率进行验证，本专利技术中的茎环引物RT5对应的ssc-miRNA-23a、ssc-miRNA-150、ssc-miRNA-181的Ct值比常规的通用茎环引物RT4对应的Ct值低0.3～4.2个值。与现有技术相比，本专利技术具有以下优点：(1)常见的miRNA定量方法为：使用特异性茎环引物进行的反转录，使用特异性的qPCR引物进行定量；而本专利技术的miRNA定量方法可以同时对多个miRNA进行反转录和定量，节约了引物合成、反转录试剂和荧光定量试剂的成本和消耗，具有操作简单、成本低、稳定性高等优点，特别适合进行miRNA的筛选；(2)而且，与目前报道的通用型RT引物进行的RT-qPCR反应相比，本专利技术提供的miRNA定量方法能够提高反应的灵敏度，对于相同浓度的miRNA而言，降低1.88～4.2个Ct值；(3)本专利技术可应用在疾病诊断、农业科学以及其它医药研发等领域。附图说明图1是实施例2中采用通用茎环法进行miRNA定量的原理；图2是实施例3中3种miRNA在不同温度下RT-qPCR产物电泳图，其中a图、b图、c图分别对应着在不同温度下使用RT1，RT2和RT3，以及使用相应的qPCR引物进行RT-qPCR反应的结果；图3a是实施例4中RT4茎环引物对应的miR-23a(虚线)灵敏度检测，RT5茎环引物对应的miR-23a(实线)；图3b是实施例4中RT4茎环引物对应的miR-150a(虚线)灵敏度检测，RT5茎环引物对应的miR-150a(实线)；图3c是实施例4中RT4茎环引物对应的miR-181(虚线)的灵敏度检测，RT5对应得miR-181(实线)的灵敏度检测；图4是实施例5中通用茎环引物RT4和改良通用茎环引物RT5的相关性比较，其中a图是RT4；b图是RT5；图5是实施例7不同本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种用于miRNA定量的改进型通用茎环引物，其特征是：其核苷酸序列是由如SEQ ID

【技术特征摘要】
1.一种用于miRNA定量的改进型通用茎环引物，其特征是：其核苷酸序列是由如SEQIDNO：1所示的碱基序列与8个简并碱基组成，使用该茎环引物能进行序列不同的miRNA的反转录，其中8个简并碱基代表：(A/C/G/T)(A/C/G/T)(A/C/G/T)(A/C/G/T)(A/C/G/T)(A/C/G/T)(A/C/G/T)(A/C/G/T)。2.采用权利要求1所述的茎环引物进行miRNA定量的方法，其特征是包括以下步骤：对不同的miRNA采用权利要求1中所述的茎环引物进行反转录，获得cDNA，然后采用qPCR引物进行qPCR反应，获得miRNA的定量结果。3.根据权利要求2所述的茎环引物进行miRNA定量...

【专利技术属性】
技术研发人员：邓盾，马现永，史圣楠，田志梅，
申请(专利权)人：广东省农业科学院动物科学研究所，
类型：发明
国别省市：广东,44