糖类抗原19-9（CA19-9）定量测定试剂盒及其制备方法与检测方法技术

本发明专利技术公开了一种糖类抗原CA19-9定量测定试剂盒，该试剂盒包括CA19-9校准品、CA19-9质控品、抗试剂、磁微粒试剂和发光底物。本发明专利技术还公开了该试剂盒的制备方法与使用该试剂盒检测糖类抗原CA19-9的方法。本发明专利技术以异硫氰酸荧光素标记的CA19-9包被抗体和碱性磷酸酶标记的CA19-9标记抗体制备抗试剂，以抗异硫氰酸荧光素抗体偶联羧基磁珠制得磁微粒试剂，使免疫反应更容易混匀和分离，而且大大提高了反应速度，以新型化学发光底物APLS为底物，提高了试剂盒的灵敏度和特异性性能。本发明专利技术的试剂盒检测灵敏度高，特异性能好、变异小，有效期可至一年以上。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于医疗器械生物类免疫体外诊断领域，主要涉及一种基于磁微粒分离化学发光法定量检测血液中糖类抗原CA19-9的试剂盒及其制备方法，以及应用该试剂盒定量检测血液中糖类抗原CA19-9的方法。
技术介绍
糖类抗原CA19-9(CarbohydrateAntigen19-9，CA19-9)，是目前临床上非常有诊断价值的一种肿瘤抗原。糖类抗原CA19-9是胰腺癌、胆囊癌、结肠癌和胃癌等相关的肿瘤标志物。多项研究表面，糖类抗原CA19-9在组织中的含量与疾病的发展阶段具有相关性。在国内，糖类抗原CA19-9检测临床上主要以国外进口试剂和免疫组化试剂应用为主，国外进口试剂价格非常昂贵，给患者带来很大的经济负担，不利于在基层普及。国产糖类抗原CA19-9免疫化学发光检测试剂盒目前还较少，也仅停留在96孔微孔板式技术水平上，该技术灵敏度较低、线性窄、特异性较差，不利于高通量的全自动检测。因此，有待开发对糖类抗原CA19-9检测灵敏度高与可靠性并能降低检测成本的检测技术。
技术实现思路
本专利技术要解决的技术问题是克服现有的缺陷，提供一种新的可定量检测糖类抗原CA19-9的试剂盒，提高检测灵敏度及可靠性，并降低成本，延长有效期。为了解决上述技术问题，本专利技术提供了如下的技术方案：一方面，本专利技术提供了一种糖类抗原CA19-9定量测定试剂盒，该试剂盒包括CA19-9校准品、CA19-9质控品、抗试剂、磁微粒试剂和发光底物。其中：一、糖类抗原CA19-9校准品、糖类抗原CA19-9质控品的配制方法如下：用标准品缓冲液溶解糖类抗原CA19-9，配置糖类抗原CA19-9校准品、糖类抗原CA19-9校准品，其中，所述校准品缓冲液是通过在1L新生牛血清中加入0.01g～0.05g的四环素和0.1g～0.5g硫酸新霉素，溶解后经过0.22μm滤膜处理制备；二、抗试剂的制备方法如下：(1)、抗试剂缓冲液的制备：Tris：12.12mg，四环素：0.01g～0.05g，绵羊血清：1g～5g，新生牛血清3g～10g，马血清1g～5g加入1L纯化水中，充分搅拌至完全溶解；(2)、异硫氰酸荧光素与糖类抗原CA19-9的偶联，获得异硫氰酸荧光素标记的CA19-9包被抗体：首先用抗试剂缓冲液将异硫氰酸荧光素配制成浓度为1.0～5.0mg/mL的异硫氰酸荧光素溶液，然后按照糖类抗原CA19-9抗体与异硫氰酸荧光素的质量之比为1:1.1，将二者同时转移到棕色玻璃瓶中，室温下搅拌1～2小时，充分反应后使用pH＝8～9的碳酸氢盐缓冲液进行平衡，然后凝胶层析分离纯化得到的异硫氰酸荧光素标记的CA19-9包被抗体；(3)、碱性磷酸酶与糖类抗原CA19-9抗体的偶联，获得碱性磷酸酶标记的CA19-9标记抗体：首先用抗试剂缓冲液将碱性磷酸酶配制成浓度为1.0～5.0mg/mL的碱性磷酸酶溶液，然后按照碱性磷酸酶与糖类抗原CA19-9的摩尔比为1:2～1:10的量将二者转移至棕色瓶中，室温下搅拌4～5小时，充分反应后使用pH＝8～9的碳酸氢盐缓冲液平衡，然后使用凝胶层析分离纯化得到的碱性磷酸酶标记的CA19-9标记抗体；注意含有连接物的试管的避光防护。(4)、将步骤(2)中获得的异硫氰酸荧光素标记的糖类抗原CA19-9包被抗体和和步骤(3)中获得的碱性磷酸酶标记的糖类抗原CA19-9标记抗体，加入含有表面活性剂的Tris盐缓冲液充，分搅拌后获得所述抗试剂；所述表面活性剂为Tween20、TritonX-100、Bronidox中的一种或多种，表面活性剂的添加量为0.01％～0.5％。本专利技术中，所述的异硫氰酸荧光素标记的CA19-9包被抗体和碱性磷酸酶标记的CA19-9标记抗体除能与糖类抗原19-9(CA19-9)抗原特异性结合外，配对使用时可与抗原形成“三明治”夹心结构。三、磁微粒试剂的制备：将抗异硫氰酸荧光素抗体与羧基磁珠偶联制得磁微粒试剂。(1)、取一定体积的充分混匀后的羧基磁珠浓缩液至反应瓶中，将该反应瓶在磁场放置15min，待羧基磁珠全部沉降后吸去上清，向反应瓶中加入2～5倍于反应瓶中羧基磁珠体积的磁微粒缓冲液，混匀20-30min。再将反应瓶置于磁场中15min后吸去上清。重复清洗羧基磁珠3遍。最后将羧基磁珠溶液定容到10-50mg/mL，混匀；(2)、连接反应：按照羧基磁珠与抗异硫氰酸荧光素抗体质量比为100:1的比例，在羧基磁珠中加入抗异硫氰酸荧光素抗体，2～8℃内保持混匀状态反应18小时；(3)、反应瓶在在磁场放置15min，待羧基磁珠沉降后用磷酸缓冲液清洗3遍，然后定容至10mg/mL，2～8℃保存，制得所需待用磁微粒试剂。四、发光底物的制备将ALPS溶解于发光底物缓冲液中制备发光底物。用4～10倍于ALPS体积的发光底物缓冲液充分溶解ALPS，所述发光底物缓冲液的配置方法是：Tris12.12g～121.14g，氯化钠5.82g，光泽精0.3g，加入1L纯化水中，充分搅拌至完全溶解，用盐酸调节缓冲液的pH至9.5。进一步的，本专利技术的糖类抗原CA19-9定量测定试剂盒，该试剂盒还包括清洗液。该清洗液主要用于在检测过程中清洗与磁微粒试剂反应后的样品，清洗液的具体组分可以参照所属领域的常规操作进行。通常是磷酸二氢钠、氯化纳、Tween20和ProcLin300的混合溶液，在试剂盒制品中可以浓缩清洗液的形式存在，检测时适当稀释后使用。优选的清洗液的配置方法是：Tris12.12g，氯化钠5.82g，Tween-2050mL，曲拉通-100，50mL，加入1L纯化水中，充分搅拌至完全溶解。另一方面，本专利技术提供了这种糖类抗原CA19-9定量测定试剂盒的制备方法，包括以下步骤。分别配制CA19-9校准品、糖类抗原CA19-9质控品、抗试剂、磁微粒试剂、发光底物；将CA19-9校准品、糖类抗原CA19-9质控品、抗试剂、磁微粒试剂、发光底物独立地置于包装容器内，得到糖类抗原CA19-9的定量测定试剂盒。再一方面，本专利技术提供了利用这种糖类抗原CA19-9定量测定试剂盒检测糖类抗原CA19-9的方法，该方法包括步骤：(1)取三支试管分别加15μL糖类抗原CA19-9的校准品、15μL糖类抗原CA19-9的质控品、15μL待测样本；(2)每一试管中加入60μL抗试剂，用塑料薄膜覆盖试管，轻轻振荡试管30s，置37℃下水浴15分钟；(3)每一试管本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种糖类抗原CA19‑9定量测定试剂盒，其特征在于，该试剂盒包括CA19‑9校准品、CA19‑9质控品、抗试剂、磁微粒试剂和发光底物；所述试剂盒中各组分按照如下方法制备：一、糖类抗原CA19‑9校准品、糖类抗原CA19‑9质控品的配制：用校准品缓冲液溶解糖类抗原CA19‑9，配置糖类抗原CA19‑9校准品和糖类抗原CA19‑9质控品；其中，所述校准品缓冲液是通过在1L新生牛血清中加入0.01g～0.05g的四环素和0.1g～0.5g硫酸新霉素，溶解后经过0.22μm滤膜处理制备；二、抗试剂的配制：(1)、抗试剂缓冲液的制备：Tris：12.12mg～60.57mg，四环素：0.01g～0.05g，绵羊血清：1g～5g，新生牛血清3g～10g，马血清1g～5g加入1L纯化水中，充分搅拌至完全溶解；(2)、将异硫氰酸荧光素标记的CA19‑9包被抗体和碱性磷酸酶标记的CA19‑9标记抗体加入到所述述抗试剂缓冲液中充分搅拌至完全溶解；三、磁微粒试剂的制备：将抗异硫氰酸荧光素抗体与羧基磁珠偶联制得磁微粒试剂；四、发光底物的制备将ALPS溶解于发光底物缓冲液中制得发光底物。

【技术特征摘要】
1.一种糖类抗原CA19-9定量测定试剂盒，其特征在于，该试剂盒包括
CA19-9校准品、CA19-9质控品、抗试剂、磁微粒试剂和发光底物；所述试剂盒
中各组分按照如下方法制备：
一、糖类抗原CA19-9校准品、糖类抗原CA19-9质控品的配制：
用校准品缓冲液溶解糖类抗原CA19-9，配置糖类抗原CA19-9校准品和糖
类抗原CA19-9质控品；其中，所述校准品缓冲液是通过在1L新生牛血清中加
入0.01g～0.05g的四环素和0.1g～0.5g硫酸新霉素，溶解后经过0.22μm滤膜处
理制备；
二、抗试剂的配制：
(1)、抗试剂缓冲液的制备：
Tris：12.12mg～60.57mg，四环素：0.01g～0.05g，绵羊血清：1g～5g，新
生牛血清3g～10g，马血清1g～5g加入1L纯化水中，充分搅拌至完全溶解；
(2)、将异硫氰酸荧光素标记的CA19-9包被抗体和碱性磷酸酶标记的
CA19-9标记抗体加入到所述述抗试剂缓冲液中充分搅拌至完全溶解；
三、磁微粒试剂的制备：
将抗异硫氰酸荧光素抗体与羧基磁珠偶联制得磁微粒试剂；
四、发光底物的制备
将ALPS溶解于发光底物缓冲液中制得发光底物。
2.根据权利要求1所述的一种糖类抗原CA19-9定量测定试剂盒，其特征
在于，所述抗试剂是按照以下步骤制备：
(1)、异硫氰酸荧光素与糖类抗原CA19-9抗体的偶联，获得异硫氰酸荧光
素标记的CA19-9包被抗体：
首先用抗试剂缓冲液将异硫氰酸荧光素配制成浓度为1.0～5.0mg/mL的异
硫氰酸荧光素溶液，按照糖类抗原CA19-9与异硫氰酸荧光素的质量之比为1:1.2
的量，将二者转移到棕色玻璃瓶中，室温下搅拌1～2小时；充分反应后使用
pH＝8～9的碳酸氢盐缓冲液进行平衡，然后凝胶层析分离纯化得到的异硫氰酸荧
光素标记的糖类抗原CA19-9包被抗体；
(2)、碱性磷酸酶与糖类抗原CA19-9抗体的偶联，获得碱性磷酸酶标记的
糖类抗原CA19-9标记抗体：
首先用抗试剂缓冲液将碱性磷酸酶配制成浓度为1.0～5.0mg/mL的碱性磷
酸酶溶液，按照碱性磷酸酶与糖类抗原CA19-9的摩尔比为1:2～1:10的量将二
者转移至棕色瓶中，室温下搅拌4～5小时，充分反应后使用pH＝8～9的碳酸氢
盐缓冲液平衡，然后使用凝胶层析分离纯化得到的碱性磷酸酶标记的CA19-9标
记抗体；
(3)、将步骤(1)中获得的异硫氰酸荧光素标记的CA19-9包被抗体和和
步骤(2)中获得的碱性磷酸酶标记的糖类抗原CA19-9标记抗体，加入含有表
面活性剂的Tris盐缓冲液，充分搅拌后获得所述抗试剂；所述表面活性剂为
Tween20、TritonX-100、Bronidox中的一种或多种，表面活性剂的添加量为
0.01％～0.5％。
3.根据权利要求1所述的一种糖类抗原CA19-9定量测定试剂盒，其特征
在于，所述磁微粒试剂是按照以下步骤制备的：
(1)、取一定体积的充分混匀后的羧基磁珠浓缩液至反应瓶中，将该反应瓶
在磁场放置15min，待羧基磁珠全部沉...

【专利技术属性】
技术研发人员：杨旻，汪丹，夏振伟，
申请(专利权)人：江苏泽成生物技术有限公司，
类型：发明
国别省市：江苏;32