一种太湖水体中浮游细菌群落的评价方法技术

本发明专利技术提供一种太湖水体中浮游细菌群落的评价方法，包括对太湖流域11个采样点的水样进行微生物基因组DNA提取，对提取的DNA通过普通PCR扩增，实时荧光定量PCR等方法定量分析样品中16S rDNA丰度；对16S rRNA基因PCR扩增后的产物进行纯化，纯化产物采用第二代高通量测序技术进行测序，测序结果经过数据处理分析后用于对水体中浮游细菌种群进行解析。该方法从基因角度揭示蓝藻水华的群落结构及与环境间的互动关系，预测环境变化可能导致群落结构发生变化的情况；采用了第二代高通量测序Miseq平台对太湖水体及底泥中的微生物群落结构进行了测定，更加系统地辅助解析太湖水体中微生物的群落结构与相应丰度。

A method for evaluating the community of planktonic bacteria in Taihu waters

The invention provides a community evaluation of planktonic bacteria in Lake Taihu, including the Taihu River 11 sample points of microbial genomic DNA extraction of DNA through PCR amplification, 16S in the sample rDNA abundance analysis quantitative real-time fluorescence quantitative PCR method; products of 16S rRNA gene was amplified by PCR after purification, purified by the second generation high-throughput sequencing technology for sequencing, sequencing results after data processing analysis is used for analyzing the population of planktonic bacteria in water. This method reveals the cyanobacteria community structure and the relationship between the environment and the interaction from the perspective of gene prediction, environmental change may lead to the change of community structure; the second generation high-throughput sequencing platform Miseq on microbial community structure in Taihu water and sediment in the determination, a more systematic analysis of microbial community structure in Taihu auxiliary in the water and the corresponding abundance.

【技术实现步骤摘要】
一种太湖水体中浮游细菌群落的评价方法
本专利技术涉及一种太湖水体中浮游细菌群落的评价方法，利用成组生物学技术对太湖水体中浮游细菌群落进行评价，属于微生物分析

技术介绍
蓝藻水华爆发是湖泊富营养化的重要表征之一，能够引发一系列的环境和生态问题。蓝藻水华聚集会导致水面覆盖，使得水生植物难以进行有效的光合作用，导致水体局部缺氧，造成鱼类等水生生物大量死亡，严重时可能引发“湖泛”；另外蓝藻水华衰亡过程中，会释放大量微囊藻毒素，危害人体及水体生态系统安全；蓝藻水华衰亡还会引发恶臭，在观感和嗅觉上对人体和环境造成不良影响。由于我国近半数以上的湖泊已处于富营养化状态，蓝藻水华频频发生，已引起各级政府的高度重视。目前，针对蓝藻水华的产生机理，国内外学者已开展了大量研究，多种理论及技术手段得以充分应用。但受条件限制，现有成果多集中在宏观领域，而对蓝藻的组织结构、生长形式、与环境因子的相关性等微观领域的研究较少。
技术实现思路
本专利技术要解决的技术问题是：为了更加系统地解析太湖水体中微生物的群落结构，本专利技术提供一种太湖水体中浮游细菌群落的评价方法，利用成组生物学技术对太湖水体中浮游细菌群落进行评价。本专利技术解决其技术问题所采用的技术方案是：一种太湖水体中浮游细菌群落的评价方法，包括以下步骤：(1)采集太湖流域共11个采样点的水样；(2)将步骤(1)中的11个水样分别用0.45μm的混合纤维素滤膜过滤并分别收集过滤出的微生物样品，待滤膜完全堵住为止；(3)对步骤(2)中过滤出的11个微生物样品分别进行DNA的提取；(4)对步骤(3)中提取的DNA样品利用超微量蛋白质核酸分析仪测定其浓度和纯度，并将DNA样品保存于-20℃下；(5)对步骤(4)中的DNA样品进行16SrDNA的普通PCR扩增，以及实时荧光定量PCR定量分析；(6)对步骤(4)中的DNA样品进行16SrRNA基因的PCR扩增，对得到的扩增产物进行纯化，得到PCR纯化产物；(7)对步骤(6)中的PCR纯化产物进行Miseq高通量测序，测序结果进行数据的降噪处理后，在处理平台上进行系统分类，对太湖水体中浮游细菌进行微生物群落解析。进一步地，在上述方案中，在步骤(5)中，所用的引物序列(5’-3’)为：正向引物CGAATATGGAATCCCTAGTAACT，反向引物GCCCACTCAGTTCGATACGC。进一步地，在上述方案中，步骤(5)中，16SrDNA的PCR扩增反应体系为25μL，反应程序为：94℃预变性5min后，95℃变性15s，退火温度58℃下反应30s，72℃延伸30s，共35个循环，最后72℃下延伸7min。进一步地，在上述方案中，步骤(5)中，在对16SrDNA进行实时荧光定量PCR(qPCR)时，预变性95℃下热变性15min；然后进入45个循环的扩增阶段，包括95℃变性15s，退火温度57.5℃下反应30s，72℃延伸30s；溶解曲线温度为60℃至95℃之间。进一步地，在上述方案中，在做高通量测序前，步骤(6)中，对16SrRNA基因进行PCR扩增时，所选的引物为序列(5’-3’)为：正向引物AGAGTTTGATYMTGGCTCAG，反向引物TGCTGCCTCCCGTAGGAGT。进一步地，在上述方案中，步骤(6)中，16SrRNA基因PCR扩增体系为50μL，PCR扩增过程为：98℃预变性5min后，98℃变性30s，退火温度50℃下反应30s，72℃延伸40s，共20个循环，最后72℃下延伸10min。进一步地，在上述方案中，步骤(6)中，将PCR扩增后的平行样混合，用E.Z.N.A.Cylcle-Pure试剂盒(OmegaBio-tecInc.,USA)进行纯化。进一步地，在上述方案中，步骤(6)中，将PCR纯化产物利用Illumina的第二代高通量测序平台Miseq进行测序分析。进一步地，在上述方案中，步骤(7)中，测序结果使用Sickle和Mothur程序进行降噪处理后，以条序列最少的样品为基准，使用Mothur软件的“Sub.sample”命令从其他样品中随机抽取相同的条序列，进行测序深度的统一；每个样品在相同的测序深度下在RibosomalDatabaseProjectClassifier处理平台上进行系统分类，得出所有细菌的解析结果。本专利技术的有益效果是，本专利技术利用了成组生物学技术，从基因角度揭示蓝藻水华的群落结构及与环境间的互动关系，预测环境变化可能导致群落结构发生变化的情况。本专利技术采用了Illumina公司的第二代高通量测序Miseq平台对太湖水体及底泥中的微生物群落结构进行了测定，综合概述微生物群落的宏基因组，可以一次对几十万到几百万条DNA分子进行序列测定，具有通量高、准确率高和成本低等诸多优点，能够更加系统地辅助解析太湖水体中微生物的群落结构与相应丰度。本专利技术对太湖蓝藻水华进行分子生物学研究，具有以下几点重要意义：1)有助于说清太湖蓝藻的形成机理。分子生物学从基因角度揭示蓝藻水华的群落结构以及与环境间的互动关系，预测环境变化可能导致群落结构发生变化的情况。2)找出制约蓝藻水华爆发的环境因子。对水体微生物种群进行研究，发现其与区域环境之间的联系，寻找通过控制环境制约因子达到避免蓝藻水华爆发的方法。3)拓展环境监测技术手段。分子生物学的应用将极大丰富环境监测部门现有的监测手段，提高环境监测部门的技术能力，为该技术在环境监测领域的深层应用奠定坚实基础。附图说明下面结合附图和实施例对本专利技术进一步说明。图1A和图1B是太湖水体采样点示意图。图2是各采样点水样样品16SrDNA丰度图。图3是各采样点水样门水平优势细菌分布图。图4是各采样点水样变形菌分布图。图5是各采样点水样属水平优势细菌分布图。图2-5中，STG：沙塘港；ZSHN：竺山湖南；JS：椒山；PTS：平台山；XSX：西山西；QD：七都；XHX：胥湖心；YYS：渔洋山；XWL：小湾里；LJK：闾江口；YPG：雅浦港。具体实施方式现在结合附图对本专利技术作进一步详细的说明。实施例1一种太湖水体中浮游细菌群落进行评价的方法，包括以下步骤：(1)采集太湖流域河口区(闾江口，沙塘港，小湾里，雅浦港)；湖心区(西山西，平台山，椒山，竺山湖南)及水草区(七都，胥湖心，渔洋山)共11个采样点的水样；采样时利用YSI水质分析仪对水温、pH、浊度、叶绿素a、藻密度和溶解氧等基本水质指标进行了测定。污水水样使用聚四氟乙烯塑料瓶进行采集；在运输过程中，所有的样品均放置在冷藏箱中保存；(2)样品的预处理：样品采集后送到实验室后立即进行预处理。采集的11个水样分别用0.45μm的混合纤维素滤膜过滤并分别收集过滤出的微生物样品，待滤膜完全堵住，记录过滤后的水样体积；过滤后的滤膜和离心后得到的固态污泥浸没于50％的乙醇中，并保存于-20℃条件下；(3)样品的DNA提取：本实验中使用FastDNASpinKitforSoil试剂盒提取DNA，其主要步骤如下：a)对于污水样品，将滤膜在室温下解冻并剪碎加入裂解管E管中(LysingMatrixEtube)，对于污泥样品，称取约0.5g离心后污泥样品放入裂解管E管中；b)向上述管中加入978μL磷酸钠缓冲液(SodiumPhosphateBuffer本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种太湖水体中浮游细菌群落的评价方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)采集太湖流域共11个采样点的水样；(2)将步骤(1)中的11个水样分别用0.45μm的混合纤维素滤膜过滤并分别收集过滤出的微生物样品，待滤膜完全堵住为止；(3)对步骤(2)中过滤出的11个微生物样品分别进行DNA的提取；(4)对步骤(3)中提取的DNA样品利用超微量蛋白质核酸分析仪测定其浓度和纯度，并将DNA样品保存于‑20℃下；(5)对步骤(4)中的DNA样品进行16S rDNA的普通PCR扩增，以及实时荧光定量PCR定量分析；(6)对步骤(4)中的DNA样品进行16S rRNA基因的PCR扩增，对得到的扩增产物进行纯化，得到PCR纯化产物；(7)对步骤(6)中的PCR纯化产物进行Miseq高通量测序，测序结果进行数据的降噪处理后，在处理平台上进行系统分类，对太湖水体中浮游细菌进行微生物群落解析。

【技术特征摘要】
1.一种太湖水体中浮游细菌群落的评价方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)采集太湖流域共11个采样点的水样；(2)将步骤(1)中的11个水样分别用0.45μm的混合纤维素滤膜过滤并分别收集过滤出的微生物样品，待滤膜完全堵住为止；(3)对步骤(2)中过滤出的11个微生物样品分别进行DNA的提取；(4)对步骤(3)中提取的DNA样品利用超微量蛋白质核酸分析仪测定其浓度和纯度，并将DNA样品保存于-20℃下；(5)对步骤(4)中的DNA样品进行16SrDNA的普通PCR扩增，以及实时荧光定量PCR定量分析；(6)对步骤(4)中的DNA样品进行16SrRNA基因的PCR扩增，对得到的扩增产物进行纯化，得到PCR纯化产物；(7)对步骤(6)中的PCR纯化产物进行Miseq高通量测序，测序结果进行数据的降噪处理后，在处理平台上进行系统分类，对太湖水体中浮游细菌进行微生物群落解析。2.如权利要求1所述的太湖水体中浮游细菌群落的评价方法，其特征在于：在步骤(5)中，所用的引物序列(5’-3’)为：正向引物CGAATATGGAATCCCTAGTAACT，反向引物GCCCACTCAGTTCGATACGC。3.如权利要求2所述的太湖水体中浮游细菌群落的评价方法，其特征在于：步骤(5)中，16SrDNA的PCR扩增反应体系为25μL，反应程序为：94℃预变性5min后，95℃变性15s，退火温度58℃下反应30s，72℃延伸30s，共35个循环，最后72℃下延伸7min。4.如权利要求3所述的太湖水体中浮游细菌群落的评价方法，其特征在于：步骤(5)中，在对16SrDNA进行实时荧光定量PCR(qPCR)时，预变性95℃下热变性15min；然后进入45个循环...

【专利技术属性】
技术研发人员：薛银刚，滕加泉，谢文理，张皓，宗玉婷，王倩，
申请(专利权)人：常州市环境监测中心，
类型：发明
国别省市：江苏,32