一种用于鉴定桑椹菌核病的特异性引物及应用该引物进行桑椹菌核病鉴定的方法技术

本发明专利技术公开了一种用于鉴定由肉阜状杯盘菌引起的桑椹菌核病的特异性引物，其特征在于：由上游引物CC‑18S‑F和下游引物CC‑18S‑R组成，所述上游引物CC‑18S‑F的核苷酸序列如SEQ ID NO：1中所示，所述下游引物CC‑18S‑R的核苷酸序列如SEQ ID NO：2中所示。本发明专利技术还公开了一种应用该特异性引物鉴定由肉阜状杯盘菌引起的桑椹菌核病的方法，该方法在桑椹菌核病的发病早期即能快速鉴定桑椹菌核病。

A specific primer for identification of mulberry Sclerotinia sclerotiorum and method for identification of mulberry Sclerotinia Sclerotiorum Using the primer

The invention discloses a method for identification of bacteria caused by caruncula cup shaped mulberry fruit sclerotiniosis specific primers, which is characterized in that is composed of CC 18S F upstream primer and downstream primer CC 18S R, the upstream primer CC 18S F nucleotide sequence of SEQ ID NO:1 in as shown, the nucleotide sequences of primer CC 18S R as shown in SEQ ID NO: 2. The invention also discloses a method for mulberry fruit sclerotiniosis is an application of the particular primer identification caused by bacteria in the cup shaped caruncula, method of early onset in mulberry fruit sclerotiniosis is the rapid identification of mulberry fruit sclerotiniosis.

【技术实现步骤摘要】
一种用于鉴定桑椹菌核病的特异性引物及应用该引物进行桑椹菌核病鉴定的方法
本专利技术属于菌核病
，具体涉及一种由肉阜状杯盘菌引起的桑椹菌核病鉴定的特异性引物及其应用。
技术介绍
桑椹菌核病又称白果病，是桑椹的主要病害，该病由真菌引起，病菌在桑椹开花时开始侵入。健康的桑椹成熟时呈紫红色，受桑实杯盘菌侵染的桑椹变白色或灰白色，花被显著肥大。病椹落地后，花被部分脱离变成黑色菌核。随着桑椹种植面积的不断扩大，桑椹菌核病持续大面积爆发，且呈蔓延趋势，严重果园甚至颗粒无收，极大地影响种植户的经济效益，威胁着桑椹产业的发展。桑椹菌核病的病原菌主要有4种，分别为核盘菌、桑实杯盘菌、肉阜状杯盘菌和核地杖菌。经研究，广东地区的桑椹菌核病病原菌主要为肉阜状杯盘菌。目前，鉴定桑椹菌核病的主要方法是表型鉴定。表型鉴定即通过观测桑椹的发病表型特征来判定桑椹菌核病是否发生。由于植株病症表型在发病中后期才能观测到，而病原菌在桑椹开花时即已侵入体内，因此表型鉴定方法对桑椹菌核病的防控意义不大。
技术实现思路
本专利技术的第一个目的在于提供一种用于鉴定桑椹菌核病的特异性引物，应用该引物可进行由肉阜状杯盘菌引起的桑椹菌核病的检测。本专利技术的第二个目的在于提供一种应用该特异性引物鉴定由肉阜状杯盘菌引起的桑椹菌核病的方法，该方法在桑椹菌核病的发病早期即能快速鉴定桑椹菌核病。本专利技术的第三个目的在于提供上述桑椹菌核病鉴定的特异性引物在制备具有鉴定桑椹菌核病功能的药物中的应用。本专利技术的第一个目的是通过以下技术方案来实现的：一种用于鉴定由肉阜状杯盘菌引起的桑椹菌核病的特异性引物，其特征在于：由上游引物CC-18S-F和下游引物CC-18S-R组成，所述上游引物CC-18S-F的核苷酸序列如SEQIDNO：1中所示，所述下游引物CC-18S-R的核苷酸序列如SEQIDNO：2中所示。根据NCBI数据库中桑椹肉阜状杯盘菌的18SrRNA(GenBankID：KY449059)序列特征，利用PrimerPremier5.0和Oligo6.0设计和筛选了上述肉阜状杯盘菌的荧光PCR特异性引物(CC-18S-F:GAGTGAGCATAAGCTCACCCCGA，如SEQIDNO：1中所示；CC-18S-R:CTCCACCCCCCGAGAGCGGTC，如SEQIDNO：2中所示)。该引物对理论扩增片段大小为344bp，该引物可由华大基因等公司合成。本专利技术的特异性引物可用于常规PCR和荧光定量qPCR本专利技术的第二个目的是通过以下技术方案来实现的：一种应用上述的特异性引物进行桑椹菌核病的鉴定的方法，其特征在于包括以下步骤：(1)取发病桑椹和健康桑椹各10个，提取这些桑椹的DNA；(2)以提取的所述发病桑椹和健康桑椹的DNA为模板，利用上述肉阜状杯盘菌的特异性引物进行荧光定量qPCR；记录发病桑椹和健康桑椹DNA的qPCR反应体系的Ct值；将测得的所有所述健康桑椹DNA的qPCR反应体系的Ct值中的最小值作为评判该桑椹是否具有桑椹菌核病的临界值；(4)取待检测的桑椹，并提取该桑椹的DNA；(5)以步骤(4)中提取的待检测桑椹的DNA为模板，利用所述肉阜状杯盘菌的特异性引物进行荧光定量qPCR，并记录所述待检测桑椹DNA的qPCR反应体系的Ct值；(6)当所述待检测桑椹DNA的qPCR反应体系的Ct值小于所述的临界值时，表明所述待检测的桑椹已感染桑椹菌核病；当所述待检测桑椹DNA的qPCR反应体系的Ct值大于或等于所述的临界值时，表明所述待检测的桑椹为健康桑椹。在上述的方法中，优选地采用DNA提取试剂盒进行桑椹DNA的提取。在本专利技术的一个优选的实施方式中，上述的荧光定量qPCR的反应体系包括：SYBRPremixExTaqⅡ(2×)10.0μL、浓度为10μM的上游引物RS-16S-F0.8μL、浓度为10μM的下游引物RS-16S-R0.8μL、模板2.0μL、双蒸水6.4μL。步骤(2)中荧光定量qPCR的扩增程序优选为：第一步95℃预变性30s，第二步95℃变性5s，55℃退火30s，72℃延伸15s，共45个循环。在本专利技术的一个优选的实施方案中，所述的临界值为35。本专利技术的第三个目的是通过以下技术方案来实现的：上述桑椹菌核病鉴定的特异性引物在制备具有鉴定桑椹菌核病功能的药物中的应用。所述的药物包括试剂盒等。有益效果：本专利技术的用于鉴定由肉阜状杯盘菌引起的桑椹菌核病的特异性引物灵敏、高效、特异性好。将该特异性引物结合荧光定量PCR所得的桑椹菌核病鉴定的方法能够在发病早期快速鉴定桑椹菌核病，为桑椹菌核病的早期防治提供可靠的依据。附图说明图1为实施例1中青枯菌荧光PCR引物特异性检测。泳道1模板为桑椹肉阜状杯盘菌DNA；泳道2模板为木霉DNA；泳道3模板为核盘菌DNA；泳道4模板为灰霉DNA；泳道5模板为黑曲霉DNA；泳道6模板为黄曲霉DNA；泳道7模板为酵母DNA；M为2000bpDNALadder；图2是实施例3中不同发病程度桑椹和健康桑椹样本的Ct值。具体实施方式在下文的实施例中，所使用的常规PCR仪为由ABI公司生产的ABI-9700型PCR仪。所使用的TaqPCRMix(2×)、DNAisoreagentkit和T-easy载体均由宝生物公司所生产。qPCR实验采用罗氏公司(Roche)生产的LightCycler480实时荧光PCR仪以及宝生物公司生产的SYBRPremixExTaqTM试剂盒进行。实施例1桑椹肉阜状杯盘菌特异引物的设计与验证1.根据NCBI数据库中桑椹肉阜状杯盘菌的18SrRNA(GenBankID：KY449059)序列特征，利用PrimerPremier5.0和Oligo6.0设计和筛选了肉阜状杯盘菌的PCR特异性引物(CC-18S-F:GAGTGAGCATAAGCTCACCCCGA/CC-18S-R:CTCCACCCCCCGAGAGCGGTC)。该引物对理论扩增片段大小为344bp，该引物由华大基因公司合成。引物稀释前先在4℃条件下，以1×104rpm离心2min，然后加入去离子水配成10μM的贮存液保存于-20℃待用；2.以木霉、核盘菌、灰霉、黑曲霉、黄曲霉和酵母等6种真菌为对照，所有实验菌株均接种于PDA培养基中，在恒温气浴摇床中以200rpm的转速，在28℃条件下培养24h。采用DNAisoreagentkit提取各菌株的DNA，保存于-20℃条件下待用；3.以肉阜状杯盘菌和各对照菌株DNA为模板，利用肉阜状杯盘菌荧光PCR特异性引物CC-18S-F和CC-18S-R进行常规PCR扩增，PCR反应体系如下：25μL的反应体系中包含12.5μLTaqPCRMix(2×)，8.5μL双蒸水，2μL模板，1μL上游引物CC-18S-F，1μL下游引物CC-18S-R。扩增反应条件为：94℃预变性5min；94℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸20s，30个循环；72℃延伸5min，4℃保存。PCR完成后，产物经1.2％琼脂糖凝胶电泳检测；4.同时将电泳条带切胶回收，连接到T-easy载体上，并转化至E.coli中，获得阳性菌落并进行测序。将测序结果在NCBI上进行比对，确定其菌属类型。结果以木霉、核盘菌、灰霉、黑曲霉、黄曲霉本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种用于鉴定由肉阜状杯盘菌引起的桑椹菌核病的特异性引物，其特征在于：由上游引物CC‑18S‑F和下游引物CC‑18S‑R组成，所述上游引物CC‑18S‑F的核苷酸序列如SEQ ID NO：1中所示，所述下游引物CC‑18S‑R的核苷酸序列如SEQ ID NO：2中所示。

【技术特征摘要】
1.一种用于鉴定由肉阜状杯盘菌引起的桑椹菌核病的特异性引物，其特征在于：由上游引物CC-18S-F和下游引物CC-18S-R组成，所述上游引物CC-18S-F的核苷酸序列如SEQIDNO：1中所示，所述下游引物CC-18S-R的核苷酸序列如SEQIDNO：2中所示。2.一种应用权利要求1所述的特异性引物进行桑椹菌核病鉴定的方法，其特征在于包括以下步骤：(1)取发病桑椹和健康桑椹各10个，提取这些桑椹的DNA；(2)以提取的所述发病桑椹和健康桑椹的DNA为模板，利用上述肉阜状杯盘菌的特异性引物进行荧光定量qPCR；记录发病桑椹和健康桑椹DNA的qPCR反应体系的Ct值；将测得的所有所述健康桑椹DNA的qPCR反应体系的Ct值中的最小值作为评判该桑椹是否具有桑椹菌核病的临界值；(4)取待检测的桑椹，并提取该桑椹的DNA；(5)以步骤(4)中提取的待检测桑椹的DNA为模板，利用所述肉阜状杯盘菌的特异性引物进行荧光定量qPCR，并记录所述待检测桑椹DNA的qPCR反应体系的Ct值；(6)当所述待检测桑椹DNA的qPCR反应体系的Ct值小于所述的临界值时，表明所述待检测的桑椹...

【专利技术属性】
技术研发人员：戴凡炜，罗国庆，唐翠明，王振江，李智毅，邝哲师，黄静，
申请(专利权)人：广东省农业科学院蚕业与农产品加工研究所，
类型：发明
国别省市：广东,44