本发明专利技术涉及一种用于特异性检测小麦条锈菌的SCAR标记及检测方法，属于生物技术和植物检疫技术领域。所述SCAR标记的核苷酸序列长度为237bp，对小麦条锈菌的检测具有高度的专化性，在检测来自我国不同麦区的小麦条锈菌标样中，该标记均稳定显现，而在小麦叶锈、秆锈及其它麦类病原真菌上均没有“污染性”扩增，可用于小麦条锈菌病害的诊断、检测和测报调查。本发明专利技术提供的检测方法，在小麦条锈菌的检测中具有较高的特异性、灵敏度和可靠性，可以在病害潜育阶段进行PCR检测，根据条锈菌特异性SCAR标记的出现概率进行病害早期预警，以提早开展病害流行测报和及时指导病害防治。
【技术实现步骤摘要】
用于特异性检测小麦条锈菌的SCAR标记及检测方法
本专利技术涉及一种用于特异性检测小麦条锈菌的SCAR标记及检测方法，属于生物技术和植物检疫
技术介绍
小麦锈病包括条锈病(PucciniastriiformisWest.f.sp.triticiEriks.)、叶锈病(PucciniareconditaRob.exDesm.f.sp.triticiErikss.EtHenn.)和秆锈病(PucciniagraminisPers.f.sp.triticiErikss.EtHenn.)三种，是一类由锈菌引致的真菌性病害。该类病害是中国乃至全世界所有产麦国家的一类重要病害，世界上不同国家或地区三种锈病发生的种类、分布与危害程度等各不相同。由小麦条锈菌Pucciniastriiformisf.sp.tritici引起的小麦条锈病是世界性的禾谷类病害，据统计，其每年在全世界范围内就可造成约40％的损失(Ullerup,1991)。我国是世界上最大的小麦条锈病流行区(万安民，2000)，发生范围涉及16个省市，病害流行时，面积超过400×104-500×104hm2，造成10％-70％的产量损失，年均产量损失100×107kg，严重情况甚至绝收(李振岐和曾士迈,2002；Chen,2005；Chenetal.,2009)。建国以来，条锈病曾于1950、1964、1990和2002年大流行，分别引起产量损失达60×108、30×108、26×108和10×108kg(Chenetal.,2009)。近年来由于新的毒性小种CY32和CY33的发展，致使我国80％的小麦生产品种丧失抗性。21世纪以来，条锈病在2001年到2009年在我国西南、西北片区连年流行，发生频率越来越高，已成为制约我国小麦可持续发展的影响因素。小麦条锈病的危害一直严重地影响着小麦生产，该类病害使谷物大量减产，品质降低，被条锈菌侵染的种子活力低，萌发率低，成活率减少。病原菌以无性孢子的形式随高空气流传播，广泛分布于我国及世界上其它的小麦种植区，是危害最重的病害。若条锈菌在小麦早期侵染，发生在生长季节，可造成小麦100％的损失。小麦条锈病曾于1950，1964，1990和2002年四次大流行，给我国小麦生产造成沉重损失。当前，小麦条锈病仍是威胁我国西南、华北和淮北等冬麦区和西北春麦区的最重要病害之一，由于其流行频率高、暴发性强、发生范围广等特点，容易造成全国大面积流行。同时，近年来新小种和新致病类型的不断出现和发展使此病害流行的可能性更高，潜在威胁更大，涉及范围更广，严重威胁小麦高产和稳产。据统计，2004年小麦条锈病发病面积近4000万亩，2005年发病面积高达1亿亩次以上，2006年小麦条锈病有所缓和，但发病面积仍高达7000万亩，2007年，发病早，流行速度快，前期危害严重，因及时防治，后期干旱，同比下降23.5％，发病面积累计约为5400万亩，虽有所缓和，仍为当前病虫害防治的重点。长期以来，小麦锈病的预测预报主要基于定期、大规模的田间病情调查和室内病菌小种的活体分离、培养和鉴定。不仅耗时费工，而且其结果的准确性和可信度也在很大程度上取决于调查测报人员的技术水平和经验，难以满足快速、高通量诊断检测的实际需求。叶锈病和条锈病的苗期症状区别不甚明显，一些基层植物保护人员常常将二者混淆，不能准确区分。在小麦叶锈菌的潜育阶段，寄主的发病症状不易观察，难以界定初侵染的时期和规模。因此，有必要利用现代生物技术，研发简单易行、灵敏准确的小麦叶锈菌快速诊断和检测手段。近年来，随着基因芯片和实时PCR技术的发展，基于特定基因序列开发的特异PCR引物或探针，已被越来越多地用在病原菌的生物学、群体结构、流行动态、基因漂移等研究中。对病害诊断、病原菌鉴定而言，靶标序列的获得通常源自保守基因的序列比较或染色体组的随机探查。DNA/RNA探针技术和聚合酶链式反应(PCR)具有强专化性、高灵敏度以及程序化试验操作等特点，现已被广泛用于丝核菌Rhizoctoniasolani、R.oryzae、R.oryzaesativae、炭疽菌Colletotrichumacutatum、多黏菌Polymyxabetae、黑粉菌Tilletiaindic、T.walkeri、Ustilagohordei、镰刀菌Fusariumoxysporum、F.culmorum、F.graminearum、F.avenaceum、叶枯菌Stagonosporanodorum、Septoriatritici等多种植物病原真菌的鉴定检测。鉴于症状诊断的局限性以及形态学鉴定的复杂性，已有学者成功研发出基于PCR技术的三种锈病的诊断检测技术。在小麦条锈菌的研究方面，中国农业科学院植物保护研究所采用PCR方法，建立了以β-微管蛋白序列为基础的小麦条锈菌和叶锈菌特异性分子诊断检测技术(曹丽华等，2007；Caoetal.,2008)。此外，美国明尼苏达大学的学者采用RT-PCR的方法，建立了以ITS1序列为区分标准的小麦三种锈菌的检测技术(BarnesandSzabo，2007)；西北农林科技大学亦采用PCR方法，建立了直接从受感染的小麦叶片中区别条锈菌的检测技术(Wangetal.,2008)。该类技术体系均是建立在核酸技术基础上，依靠病原菌基因组中的特异性DNA序列进行检测，包括样品提取、PCR扩增以及扩增产物的分析，用于病害诊断检测的准确性和可靠性均较高。
技术实现思路
本专利技术请求保护的技术方案如下：小麦条锈菌(Pucciniastriiformis)检测的SCAR标记，其核苷酸序列如SEQIDNO:1所示。用于小麦条锈菌(Pucciniastriiformis)检测的SCAR标记引物，其核苷酸序列为：PSTF117：5’-CACGCGGGACGTACTTATTGTC-3’，PSTR363：5’-CATTTCTGGCGAACATGGAATC-3’。一种检测小麦感染条锈菌(Pucciniastriiformis)的方法，包括如下步骤：(1)以待测小麦为材料，提取样品DNA；(2)以样品DNA为模板，采用上述SCAR标记引物进行PCR反应，得到扩增产物；(3)琼脂糖凝胶电泳检测扩增产物，若扩增产物中出现237bp特征条带，则所述样品DNA中含有小麦条锈菌；若扩增产物的大小不是237bp，则样品DNA中不含有小麦条锈菌。所述PCR反应的体系为：20ng/μL模板DNA1μL，10μM引物PSTF1171μL，10μM引物PSTR3631μL，2×EasyTaqPCRSuperMix12.5μL，ddH2O9.5μL。所述PCR反应的条件为：94℃预变性4min；94℃变性30s、55.5℃退火30s、72℃延伸1min，35个循环；72℃延伸8min。用于检测小麦条锈菌的试剂盒，其特征在于：包括液态的或粉状的用于小麦条锈菌(Pucciniastriiformis)检测的SCAR标记引物，其核苷酸序列为：PSTF117：5’-CACGCGGGACGTACTTATTGTC-3’，PSTR363：5’-CATTTCTGGCGAACATGGAATC-3’。本研究根据真菌的保守基因合成引物Bt2a/Bt2b本文档来自技高网...
【技术保护点】
小麦条锈菌(Puccinia striiformis)检测的SCAR标记，其核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。
【技术特征摘要】
1.小麦条锈菌(Pucciniastriiformis)检测的SCAR标记，其核苷酸序列如SEQIDNO:1所示。2.用于小麦条锈菌(Pucciniastriiformis)检测的SCAR标记引物，其核苷酸序列为：PSTF117：5’-CACGCGGGACGTACTTATTGTC-3’，PSTR363：5’-CATTTCTGGCGAACATGGAATC-3’。3.一种检测小麦感染条锈菌(Pucciniastriiformis)的方法，包括如下步骤：(1)以待测小麦为材料，提取样品DNA；(2)以样品DNA为模板，采用权利要求2所述的SCAR标记引物进行PCR反应，得到扩增产物；(3)琼脂糖凝胶电泳检测扩增产物，若扩增产物中出现237bp特征条带，则所述样品DNA中含有小麦条锈菌；若扩增产物的大小不是237bp，则样品DN...
【专利技术属性】
技术研发人员：高利，陈万权，刘太国，刘博，
申请(专利权)人：中国农业科学院植物保护研究所，
类型：发明
国别省市：北京;11
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