小麦条锈菌与叶锈菌的复合ＰＣＲ检测鉴定试剂盒，属于生物技术、农作物病害防治和植物检疫技术领域。该试剂盒利用源自真菌β－微管蛋白基因保守序列和小麦条锈菌、叶锈菌特异序列的三条引物，在一次ＰＣＲ反应中，同时检测小麦条锈菌１７１ｂｐ、叶锈菌２２６ｂｐ的特异性基因组ＤＮＡ序列。是对小麦条锈菌和叶锈菌特异性引物检测方法的补充和改进，也适用于病害症状显现之前、受侵染小麦叶片内条锈菌与叶锈菌的诊断检测。本试剂盒采用复合ＰＣＲ技术，在ＰＣＲ－ＳＭＡＲＴ反应液中，三条引物同时扩增，提高了检测的准确性，节约了检测时间，且操作简便，可供我国植保、植检部门推广应用。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于生物技术、农作物病害防治和植物检疫领域，具体涉及一种小麦条锈 菌与叶锈菌的复合PCR检测鉴定试剂盒。
技术介绍
小麦锈病属世界性禾谷类病害，发生范围广，流行成灾率高，危害严重，是影响小 麦安全生产的重要生物灾害，大流行年份可导致小麦减产30%左右，特大流行年份则可减 产50% 60%，甚至绝收。作为我国第二大粮食作物，小麦生产直接关系到我国的粮食安 全问题。但在我国不同小麦种植区内，锈菌菌源大规模交流扩散、锈病流行循环往复。 小麦条锈病和叶锈病在症状上的共同特点是发病初期麦叶上出现褪绿斑点，继而 在发病部位产生铁锈色的粉疱(夏孢子堆)，后期再产生黑色疱斑(冬孢子堆)。小麦锈菌 寄生专化性强，无法人工培养，且尚未发现有性世代，长期以来，病菌常规的小种鉴定及监 测均基于鉴别寄主来进行，锈病发生种类与状况的预测预报也主要基于定期、大规模的田 间病情调查和室内病原菌的活体分离、培养和鉴定。不仅耗时费工，而且其结果的准确性和 可信度也在很大程度上取决于调查测报人员的经验技术，难以满足快速、高通量诊断检测 的实际需求。通常，小麦锈菌成功侵染寄主小麦后， 一般具有9-14天甚至更长时间的潜育 扩展阶段。在此期间，寄主小麦的发病症状不易观察，因此初侵染的时期和规模难以界定； 在苗期小麦上，条锈病和叶锈病的典型症状不明显，一些基层植保人员常常将二者混淆，不 能准确区分，因此难以开展及时有效的化学防治工作。而锈病症状一旦显现、病原菌即可在 小麦叶片上大量繁殖产生夏孢子。这些病原菌孢子可随气流进行大范围的传播扩散，导致 病害的流行爆发。 开展锈菌不同种的早期诊断与监测，可以解决常规病原菌检测鉴定方法繁杂、费 工费时的实践难题。同时，在病害侵染循环的早期阶段，界定发病的初始时期与规模，有助 于提高病害中长期测报水平，正确评判病害的流行趋势；也有助于制定合理的防治阈值，科 学决策防治时机，并确定杀菌剂的使用剂量与时期，在最大限度降低病害防治成本的基础 上，规避病害流行风险。 在病害预测预报和病原菌鉴定检疫方面，国际上多采用血清学检测(如ELISA和 免疫荧光)和DNA杂交、PCR分析等技术。其中，PCR技术是利用特异引物，在DNA聚合酶的 催化下，对靶标DNA序列进行体外扩增，根据预期DNA条带的有无来判断检测结果。与传统 的病原菌检测分析技术相比，PCR试剂盒分析技术具有灵敏度高，特异性强、使用简单、操作 迅捷等特点。 目前国内外尚无小麦条锈菌和叶锈菌检测区分的PCR专用试剂盒。
技术实现思路
本专利技术目的是提供用于检测区分小麦锈菌不同种的PCR试剂盒。该试剂盒利用源 自真菌P-微管蛋白基因保守序列和小麦条锈菌、叶锈菌特异序列的三条引物，在同一PCR反应体系中同时检测小麦条锈菌和叶锈菌。 本专利技术的技术方案如下 本专利技术为小麦条锈菌与叶锈菌的复合PCR检测鉴定试剂盒，该试剂盒由以下几种 试剂组成 (1) PCR-SMART反应液 其中含有10XPCR Buffer, dNTP Mixture以及小麦锈菌不同种的PCR检测专用引 物Primer A、 Primer B禾口 Primer C。 Primer A序歹lj (5' -ACCCACAACCGCCAACATGCGTGA-3')源自小麦秆枯菌 (S印toria nodorum)的P _微管蛋白基因的保守序列(EMBLS56922) ;PrimerB序列 (5， -CTCATCAGGTAGCCCATCGT-3')源自小麦叶锈菌的SCAR标记(GenBank accession EU084038) ;Primer C序列(5' -TTAAGACTACCGGTGTGAAC-3')源自小麦条锈菌的SCAR标记 (GenBank accession EF666109)。Primer A/B可以专化性扩增出小麦叶锈菌226bp的特异性条带，而PrimerA/C可以专化性扩增出小麦条锈菌171bp的特异性条带。 (2)Taq酶； (3)条锈菌阳性对照； (4)叶锈菌阳性对照； (5)分子量标记； (6)超纯水； (7)凝胶上样缓冲液。 试剂盒具体组成可以为(100次) (1) PCR-SMART反应液1. Oml l支 内含10XPCR Buffer(tris-cl 100mmol/L， Kcl 500,1/L， Mgcl2 25mmol/ L)0.33ml， dNTP Mixture (lOmmol/L) 0. 27ml ， Primer A (10 ii mol/L) 0. 20ml ， Primer B(10iimol/L)0. 10ml ， Primer C (10 ii mol/L) 0. 10ml 。(2) Taq酶 5U/ ii 150 ii 1l支(3)条锈菌阳性对照1mll支(4)叶锈菌阳性对照1mll支(5)分子量标记1mll支(6) ddH205mll支 (7)6X凝胶上样缓冲液1ml 1支试剂盒的储存及有效期储存于_20°C ;避免反复冻融；有效期为12个月。 适用仪器PCR检测仪。 本专利技术试剂盒的使用方法如下 ①PCR反应体系的建立 取出PCR-SMART反应液，室温融化、颠倒混匀后，向每个PCR薄壁反应管内加入 7. 5 ill ;再分别加入0. 5 ill Taq酶、16 ddH20、 1 ii 1被测样品的DNA模板(20ng/ ii 1)， 盖好PCR薄壁反应管盖。 ②PCR扩增 将PCR薄壁反应管置于PCR仪中，设定PCR反应程序94。C预变性5min， 1个循环； 94。C变性30S， 55。C退火30S， 72。C延伸40S， 35个循环；72。C延伸5min 1个循环。 ③PCR产物鉴定 取3 5 ill PCR扩增产物，用质量分数2. 0的琼脂糖凝胶、0. 5 X T BE电泳缓冲液 电泳分离；同时上样5iU/孔的分子量标记与条锈菌、叶锈菌的阳性对照；电泳结束、经溴 化乙锭染色后，以紫外凝胶成像系统分析判断扩增产物的有无与大小。 有益效果本专利技术是用于检测小麦锈菌不同种的复合PCR试剂盒，可用于检测和 区分小麦条锈菌与叶锈菌的夏孢子，也可用于检测和确定无明显发病症状的小麦材料是否 被不同种的小麦锈菌所侵染。与国内外现有方法相比，本专利技术具有以下的技术优势 (1)检测准确性高。本试剂盒可专化性扩增小麦条锈菌(GenBank accessionEF666109)和叶锈菌(GenBank accession EU084038)不同SCAR标记的相应序 列。 (2)操作简便快捷。本专利技术采用复合PCR技术，三条引物在同一反应体系中同时扩 增，扩增模板可以为源于锈菌孢子或感病小麦叶片的总DNA。实验操作简单、快速、高效，一 般整个检测过程可在4个小时内完成。 (3)特异性强。本试剂盒可特异性检测小麦条锈菌和叶锈菌，而在其它麦类病原真 菌中无扩增产物。具体实施例方式下面结合实施例对本专利技术作详细说明，但并不以任何方式限制本专利技术。 实施例1感病小麦叶片与锈菌夏孢子的复合PCR检测及其特异性分析。 ①在人工气候室内分别以小麦叶锈菌07-24-17、条锈菌S23单独或混合接种铭贤169小麦幼苗，7天后采集病叶提取基因组本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种小麦条锈菌与叶锈菌的复合ＰＣＲ检测鉴定试剂盒，其特征在于该试剂盒由以下几种试剂组成： （１）ＰＣＲ－ＳＭＡＲＴ反应液：其中含有三条小麦锈菌不同种的ＰＣＲ专用引物，其序列为： 引物Ａ：５’－ＡＣＣＣＡＣＡＡＣＣＧＣＣＡＡＣＡＴＧＣＧＴＧＡ－３’ 引物Ｂ：５’－ＣＴＣＡＴＣＡＧＧＴＡＧＣＣＣＡＴＣＧＴ－３’ 引物Ｃ：５’－ＴＴＡＡＧＡＣＴＡＣＣＧＧＴＧＴＧＡＡＣ－３’， （２）Ｔａｐ酶； （３）条锈菌阳性对照； （４）叶锈菌阳性对照； （５）分子量标记； （６）超纯水； （７）凝胶上样缓冲液。
【技术特征摘要】
一种小麦条锈菌与叶锈菌的复合PCR检测鉴定试剂盒，其特征在于该试剂盒由以下几种试剂组成(1)PCR-SMART反应液其中含有三条小麦锈菌不同种的PCR专用引物，其序列为引物A5’-ACCCACAACCGCCAACATGCGTGA-3’引物B5’-CTCATCAGGTAGCCCATCGT-3’引物C5’-TTAAGACTACCGGTGTGAAC-3’，(2)Tap酶；(3)条锈菌阳性对照；(4)叶锈菌阳性对照；(5)...
【专利技术属性】
技术研发人员：曹丽华，孟颢光，陈万权，徐世昌，刘太国，蔺瑞明，王振跃，
申请(专利权)人：河南农业大学，
类型：发明
国别省市：41[中国|河南]
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