无柄灵芝126菌株或其子实体分子标记及其获得方法与应用技术

本发明专利技术涉及一种无柄灵芝１２６菌株或其子实体分子标记及其获得方法与应用，该标记是ＰＣＲ扩增后为１５７２ｂｐ的特异ＤＮＡ片断，其ＰＣＲ扩增引物对序列为５′ＧＡＣＡＴＡＣＣＴＴＧＣＣＡＧＣＧＴＴＣ　３′和５′ＣＣＣＣＡＴＣＡＡＴＡＣＴＣＣＣＴＡＣＡＡ　３′；获得方法：１）菌株或子实体基因组ＤＮＡ的提取；２）获得特异ＤＮＡ片段；３）获得特异ＰＣＲ扩增引物；４）用特异ＰＣＲ扩增引物对对无柄灵芝１２６菌株或子实体的基因组ＤＮＡ进行扩增；５）琼脂糖凝胶电泳检测；应用：用于快速鉴定和检测无柄灵芝１２６菌株及市售灵芝类产品的真伪。本方法与常规形态学检测、拮抗试验、出菇试验相比，具有检测时间短，准确性高的优点。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属灵芝菌株鉴别领域，特别是涉及一种无柄灵芝126菌株或其子实体分子标 记及其获得方法与应用。
技术介绍
据《神农本草经》和《本草纲目》记载，灵芝有益心气、养心生血、助心充脉、安神、 益脾益肺、强筋骨、利关节、治耳聋等功效。近代研究发现灵芝不但对人类三大死因的癌 症、脑溢血和心脏病有疗效，还对胃肠、肝脏、肾脏、白血病、神经衰弱、慢性支气管炎、 哮喘、过敏等疾病有显著疗效。此外灵芝还有强精、消炎、镇痛、抗菌、解毒、利尿、 净血等多种作用和功效。近年来，国际药学界发现灵芝所含有机锗是人参的4一5倍，锗被 认为是长寿元素，能促进血液循环，增强血红蛋白携氧能力，提高代谢功能、延缓衰 老。因此，灵芝被誉为健康食品之冠(虞和澍，1994)。随着对灵芝的生物学功效的不断了解，以其为原料开发的产品越来越多，销售量也越 来越大，灵芝原料的质量越来越受到重视。近年来，随着灵芝各种产品的商品化，大大带 动了中国灵芝栽培生产的迅速发展，同时灵芝的种质资源也在不断扩大，但是由于我国食 药用菌品种登记制度尚未完善，因此灵芝的生产用菌种比较混乱，同种异名和异名同种的 现象在栽培生产上非常普遍，这不仅给菌种的管理带来了难度，也给以灵芝为原料的保健 品及药品等的相关产业造成了一定的经济损失。现在因为菌种问题常常造成我国灵芝产品 质量难以稳定的局面，也严重地制约了我国灵芝产品走出国门，走向国际市场的步伐。传统的分类鉴定主要依据子实体的形态学特征来进行，包括担孢子的大小和子实体真 皮菌丝的形态特征，但是子实体的许多形态学特征往往随着生长条件的不同而发生变化， 而且许多鉴别性特征经常是几个种所共有的，这给传统的分类学带来了很大的困难，仅仅 依据形态学特征进行菌种鉴定不是很可靠。因此，寻找可靠的鉴定手段，对灵芝产业的进 一步发展尤为重要。近年来，国内对栽培灵芝菌株的分类研究也越来越多，主要是集中在应用拮抗实验、 RAPD (Random amplified polymorphic DNA，随机扩增的多态性DNA)分析及同工酶分析 技术方面。张松等(1995)通过对4株灵芝菌株的酯酶同工酶酶谱的分析发现，供试的四个菌株 存在5条相同的酶带，说明它们具有灵芝的某些共同的遗传特征，在其代谢过程中具有某 些相似的生理活动，但各菌株在酶带数目、Rf值及含量百分比上存在差异，均具有自己的特征酶带，同时发现子实体形态学特征相似的，酯酶同工酶酶谱也相似，亲缘关系比较近， 这些说酯酶同工酶分析对于灵芝的分类鉴定有一定的价值。赵明文等(2003)利用RAPD技术对生产中常用的灵芝属8个菌株的亲缘关系进行了 分析。根据UPGMA构建的树状图将8个菌株在较低的相似水平上分成3个明显不同的组 第1乡且包括黑芝(Gaocfenwa c^nw2)、松杉灵芝(Gtfwocfenwa wgae)、圆芝(Gflwofiferwa ra加i/o^ww)、灵芝0770 (Gawoderwa 0770)禾卩韩国灵芝(Gtmoc/eww /w'^/附HG);第2组包括密纹灵芝(Gww^w cre办my/r&fe附)和紫灵芝(GwAr附Wwmye);第3 组为树舌灵芝(G朋oAr附a印/7/朋^wm)。这一结果与经典分类结果基本相符，表明RAPD 技术可以用来区分生产中一些常用的灵芝种，同时说明灵芝生产用种之间遗传差异较大， 可能是造成灵芝产品研究比较混乱的重要原因。1999年我国签署了《国际植物新品种保护法》，这不仅要求我们尊重其它国家的品种 知识产权，同时也要加强保护我们国家自己的品种知识产权，为了建立食用菌新品种登记 制度来真正保护我国的品种产权，必须首先建立成熟的品种鉴定技术，为新品种登记奠定 基础。随着分子生物学技术的快速发展，特别是分于标记和基因标记技术的建立与成熟，为 发展简便、快速、准确的鉴定技术提供了有效手段。SCAR(Sequence Characterized Amplified Region)标记是一种十分稳定的分子标记，在应用上具有迅速、简便、低成本的特点，但 目前尚未有对无柄灵芝126的SCAR分子标记，以快速鉴定无柄灵芝126。
技术实现思路
本专利技术所要解决的技术问题是提供一种无柄灵芝126菌株或其子实体特异性分子 标记及其获得方法与应用，以便对无柄灵芝菌种126进行简便、快速、准确的鉴定和检测。本专利技术的一种无柄灵芝126菌株或其子实体特异性分子标记，是一种基因SCAR 分子标记，是PCR扩增后为1572bp的特异DNA片断，其PCR扩增引物对序列为 5'GACATACCTTGCCAGCGTTC 3'禾n 5'CCCCATCAATACTCCCTACAA 3'。本专利技术的一种无柄灵芝126菌株或其子实体特异性分子标记的获得方法，包括下 列步骤I.菌株或子实体基因组DNA的提取 (1)菌株基因组DNA的提取将4-6'C保藏的无柄灵芝126菌株转接到PDA斜面上，26-28'C培养活化，5-7天后转接 到马铃薯葡萄糖培养液中，26-28'C振荡培养10-14天，收集菌丝，用LETS法提取基因组7DNA;(2)子实体基因组DNA的提取将子实体l-2g剪碎，用体积比为1:2-3的95% (V/V)酒精和0.5 mol/L EDTA Na2 混合物浸泡处理20-30小时，过滤，水冲洗，研磨粉碎后，加入800-1000pLpH8.0CNETS 溶液分装于2ml离心管中，60-70'C保温1-3小时，10000-12000g离心2-5min后，取上清， 按照酚/氯仿法提取子实体基因组DNA，其中的CNETS溶液组成是l%(m/V)CTAB、 1 mol/L NaCl、 10mmol/LEDTA、 20 m mol/L Tris-Cl、 l%(m/V)SDS。II. 无柄灵芝126菌株或子实体特异DNA片段的获得采用ISSR-PCR法，其中ISSR弓I物为5'TTCCCTTCCCTTCCC3',经大量筛选试验， 得无柄灵芝126菌株或子实体特异DNA片段；III. 特异性PCR引物的获得以得到的特异性DNA片段的序列为基础，设计特异PCR扩增引物，引物对的序列 5'GACATACCTTGCCAGCGTTC 3'禾口 5'CCCCATCAATACTCCCTACAA 3';IV. 用特异PCR扩增引物对对无柄灵芝126菌株或子实体的基因组DNA进行PCR 扩增V. 琼脂糖凝胶电泳检测上述PCR扩增产物6-8nL，与0.5pL加样缓冲液混匀，点样于1.2-l，/。的琼脂糖凝胶上， 于1.0XTAE缓冲液中，5V/cm电压下电泳，电泳结束后，用溴化乙锭溶液染色5-10min，凝 胶成像仪上照相。所述步骤I (1)中，LETS法① 将冻干的菌丝大约20-30mg置于预冷的无菌研钵中迅速研磨成细粉，后迅速向研钵中加 入1000ml已配置好的LETS缓冲液，分装于2个1.5ml的离心管中；② 向每个管中加入600-800piL的苯酚:氯仿异:戊醇(缩写为PCI)(比例为25:24:1)上下 颠倒，充分混匀，4-l(TC 16000g离心8-I5分钟;③ 轻轻吸取上清于新的离心管中，加入50(VL的PCI， 4°C 16000g离心8-15分钟；④ 重复步骤(D本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种无柄灵芝１２６菌株或其子实体特异性分子标记，其特征在于：该标记是一种基因ＳＣＡＲ分子标记，是ＰＣＲ扩增后为１５７２ｂｐ的特异ＤＮＡ片断，其ＰＣＲ扩增引物对序列为５′ＧＡＣＡＴＡＣＣＴＴＧＣＣＡＧＣＧＴＴＣ　３′和５′ＣＣＣＣＡＴＣＡＡＴＡＣＴＣＣＣＴＡＣＡＡ　３′。

【技术特征摘要】
1.一种无柄灵芝126菌株或其子实体特异性分子标记，其特征在于该标记是一种基因SCAR分子标记，是PCR扩增后为1572bp的特异DNA片断，其PCR扩增引物对序列为5′GACATACCTTGCCAGCGTTC 3′和5′CCCCATCAATACTCCCTACAA 3′。2. —种无柄灵芝126菌株或其子实体特异性分子标记的获得方法，包括下列步骤I. 菌株或子实体基因组DNA的提取(1) 菌株基因组DNA的提取 将4-6'C的无柄灵芝126菌株转接到PDA斜面上，26-28'C培养活化，5-7天后转接到马铃薯葡萄糖培养液中，26-28振荡培养10-14天，收集菌丝，用LETS法提取基因组DNA， DNA 稀释至10-20ng/nL，保存备用；(2) 子实体基因组DNA的提取将子实体l-2g剪碎，用体积比为1:2-3的95% V/V酒精和0.5 mol/L EDTA Na2混合 物浸泡处理20-30小时，过滤，水冲洗，研磨粉碎后，加入800-1 OOOpL pH 8.0 CNETS溶 液分装于2ml离心管中，60-70'C保温1-3小时，10000-12000g离心2-5min后，取上清， 按照酚/氯仿法提取子实体基因组DNA，其中的CNETS溶液组成是l%(m/V)CTAB、 1 mol/L NaCl、 10mmol/LEDTA、 20 m mol/L Tris-Cl、 l%m/VSDS;II. 无柄灵芝126菌株或子实体特异DNA片段的获得采用ISSR-PCR法，其中ISSR引物为5'TTCCCTTCCCTTCCC3'，得无柄灵芝121 菌株或子实体特异DNA片段；III. 特异性PCR引物的获得以得到的特异性DNA片段的序列为基础，设计特异PCR扩增引物，引物对的序列 5'GACATACCTTGCCAGCGTTC 3'和5'CCCCATCAATACTCCCTACAA 3';IV. 用特异PCR扩增引物对对无柄灵芝126菌株或子实体的基因组DNA进行PCR 扩增V. 琼脂糖凝胶电泳检测。3. 根据权利要求2所述的无柄灵芝126菌株或其子实体特异性分子标记的获得方法， 其特征在于所述步骤I (1)中，LETS法，①将冻干的菌丝大约20-30mg置于预冷的无 菌研钵中迅速研磨成细粉，后迅速向研钵中加入1000ml已配置好的LETS缓冲液，分装于 2个1.5ml的离心管中；②向每个管中加入600-800nL的苯酚:氯仿异:戊醇PCI比例为25:24:1上下 颠倒，充分混匀，4-10°C 16000g离心8-15分钟；③ 轻轻吸取上清于新的离心管中，加入500pL的PCI， 4°C 16000g离心8-15分钟；④ 重复步骤③，直到两相的界面没有杂质为止；⑤ 取上清，向上清液中加入2倍体积的己-2(TC预冷的无水乙醇或95^乙醇，轻轻混匀， 置于-2(TC冰箱中静置5-10分钟；⑥ 取出，4'C16000g离心10-15分钟;⑦ 倒去上清，再向管中加入50(^L预冷的70Q/oV/V乙醇，用指头轻轻敲打沉淀使其溶 解，静置一会儿，4。C16000g离心10分钟;⑧ 重复步骤⑦1次；⑨ 倒去上清，待管中酒精挥发后，加入适量体积的TE缓冲液pH8.0，按100mlTE缓冲液 加入2pL lmg/ml的DNase-free RNase; 37。C温浴1-2个小时；⑩ 将获得的基因组DNA经过ITS-PCR扩增后再...

【专利技术属性】
技术研发人员：唐传红，张劲松，刘艳芳，许美燕，贾薇，杨焱，唐庆九，郝瑞霞，周帅，冯娜，刘方，
申请(专利权)人：上海市农业科学院，
类型：发明
国别省市：31[中国|上海]