用于检测小麦叶锈的胶体金试纸条制造技术

本发明专利技术提供一种用于检测小麦叶锈的胶体金试纸条，包括样品垫、金标垫、NC膜、吸水纸和PS底板；所述样品垫、金标垫、NC膜和吸水纸按样品层析方向依次设置于PS底板上；所述金标垫上包被有胶体金标记的抗小麦叶锈菌的单克隆抗体；所述NC膜上按样品层析方向依次包括检测线和质控线，所述检测线上包被有所述单克隆抗体特异识别的小麦叶锈菌抗原蛋白；所述质控线上包被有羊抗鼠二抗。所述抗小麦叶锈菌的单克隆抗体由保藏号为CGMCC No.10884的杂交瘤细胞所分泌。采用本发明专利技术试纸条进行检测，从取材到获得检测结果仅需15分钟，操作简便，结果准确，能够对小麦叶锈病进行早期预警，减少病害造成的经济损失。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及小麦叶锈病防治领域，具体涉及一种用于检测小麦叶锈的胶体金试纸条。
技术介绍
小麦叶锈病(PucciniareconditaRob.exDesm.f.sp.triticiErikss.Et Henn.)是由小麦叶锈菌引致的真菌性病害，该病害是中国乃至全世界所有产麦国家的一类重要病害，严重发生时会造成15％以上的产量损失。长期以来，小麦锈病的预测预报主要基于定期、大规模的田间病情调查和室内病菌小种的活体分离、培养和鉴定。不仅耗时费工，而且其结果的准确性和可信度也在很大程度上取决于调查测报人员的技术水平和经验，难以满足快速、高通量诊断检测的实际需求。叶锈病和条锈病的苗期症状区别不甚明显，一些基层植物保护人员常常将二者混淆，不能准确区分。在小麦叶锈菌的潜育阶段，寄主的发病症状不易观察，难以界定初侵染的时期和规模。因此，有必要利用现代生物技术，研发简单易行、灵敏准确的小麦叶锈菌快速诊断和检测手段。近年来，随着基因芯片和实时PCR技术的发展，基于特定基因序列开发的特异PCR引物或探针，已被越来越多地用于病害诊断、病原菌鉴定中。DNA/RNA探针技术和聚合酶链式反应(PCR)具有强专化性、高灵敏度以及程序化试验操作等特点，现已被广泛用于多种植物病原真菌的鉴定检测。中国农业科学院植物保护研究所采用PCR方法，建立了以β-微管蛋白序列为基础的小麦条锈菌和叶锈菌特异性分子诊断检测技术(曹丽华等，2007；Cao et al.,2008)。该类技术体系是建立在核酸技术基础上，依靠病原菌基因组中的特异性DNA序列进行检测，包括样品提取、PCR扩增以及扩增产物的分析，用于病害诊断检测的准确性和可靠性均较高。然而，该方法步骤繁琐，从取样到获得结果需要一天时间，费时费力，并且需要在实验室内进行。因此，需要开发一种快速、简便、准确的检测小麦叶锈菌的方法，可以随时检测待测植株是否感染了小麦叶锈菌，从而对小麦叶锈进行早期预警。
技术实现思路
根据上述领域存在的不足和需求，本专利技术提供一种用于检测小麦叶锈的胶体金试纸条及其检测方法，该方法不需要仪器设备，在野外即可进行检测，能够快速准确地判断待测植株是否患有小麦叶锈病。本专利技术请求保护的技术方案如下：抗小麦叶锈菌的单克隆抗体，由保藏号为CGMCC No.10884的杂交瘤细胞所分泌。分泌抗小麦叶锈菌的单克隆抗体的杂交瘤细胞株，其保藏号为CGMCC No.10884。用于检测小麦叶锈的胶体金试纸条，包括样品垫、金标垫、NC膜、吸水纸和PS底板；所述样品垫、金标垫、NC膜和吸水纸按样品层析方向依次设置于PS底板上；其特征在于：所述金标垫上包被有胶体金标记的权利要求1所述的的单克隆抗体；所述NC膜上按样品层析方向依次包括检测线和质控线，所述检测线上包被有小麦叶锈菌抗原蛋白，其氨基酸序列如Seq ID No.1所示；所述质控线上包被有羊抗鼠二抗。所述金标垫上的抗体包被浓度为0.12ug/cm。所述NC膜检测线上的抗原蛋白包被浓度为2mg/ml。所述NC膜质控线上包被的抗体为羊抗鼠二抗，其包被浓度为0.5mg/ml。用于检测小麦叶锈菌的方法，其特征在于，采用权利要求3～6所述的胶体金试纸条按照下列步骤进行检测：(1)将待测样品滴加在样本垫上；(2)待质控线显色后，观察检测线是否由无色变成红色；若检测线变成红色，则待测样品中不含有小麦叶锈菌；若检测线不变色，则待测样品中含有小麦叶锈菌。用于制备抗小麦叶锈菌单克隆抗体的方法，其特征在于，以Seq ID No.1所示的小麦叶锈菌抗原蛋白作为免疫原免疫实验动物。本专利技术请求保护的抗小麦叶锈菌的单克隆抗体，其亚型为IgG1型，能够特异识别小麦叶锈菌的孢子。该抗体由保藏号为CGMCC No.10884的杂交瘤细胞所分泌，其效价高、亲和力强、特异性好，与常见的小麦条锈菌、杆锈菌和黑粉菌无交叉反应，可用于检测样品是否含有小麦叶锈菌。本专利技术还请求保护分泌抗小麦叶锈菌的单克隆抗体的杂交瘤细胞株，其保藏号为CGMCC No.10884。本专利技术提供用于检测小麦叶锈菌的胶体金试纸条，包括样品垫、金标垫、NC膜、吸水纸和PS底板，利用胶体金夹心法检测样品中是否存在小麦叶锈菌。其检测原理为：样品滴加在样品垫上后，便朝着吸水纸的方向泳动，金标垫上胶体金标记的抗小麦叶锈菌的单克隆抗体(金标抗体)溶解，若样品中没有小麦叶锈菌，那么当金标抗体到达NC膜上的检测线时，金标抗体被检测线上包被的小麦叶锈菌抗原蛋白捕获，沉积下来使检测线变成红色，多余的金标抗体继续向前泳动，被质控线上的羊抗鼠二抗捕获，使质控线呈现红色。若样本中含有小麦叶锈菌，则金标抗体与小麦叶锈菌孢子结合后向前泳动，越过检测线，在质控线上被羊抗鼠二抗捕获，使质控线呈现红色，而检测线不变色。只有当质控线呈现红色时，该检测结果才有效。本专利技术还提供用于检测小麦叶锈菌的方法，该方法操作简单易行，只需将病菌孢子用0.02mol/l PBS缓冲液处理后，滴加在本专利技术试纸条的样本垫上，室温反应约5-10min后，待质控线显色后，观察检测线是否由无色变成红色；若检测线变红，则表明待测样品中不含有小麦叶锈菌或者待测植株感染了小麦叶锈菌；若检测线不变色，则待测样品中含有小麦叶锈菌。采用本专利技术试纸条进行检测，不需要仪器设备，在实验室和野外均可进行，从取材到获得检测结果仅需15分钟，操作十分轻松，能够对小麦叶锈病进行早期预警，以便及时采取防治措施，减少病害造成的经济损失。生物保藏信息：生物材料名称：Lr-2-3分类命名：对小麦叶锈菌的单克隆抗体杂交瘤细胞株保藏日期：2015年06月05日保藏号:CGMCC No.10884保藏机构：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所具体实施方式以下通过具体实施例对本专利技术进行解释和说明，需要声明的是，下述实施例仅作为举例说明，而不以任何方式限制本专利技术的范围。生物材料小麦叶锈菌：中国农业科学院植物保护研究所麦类病害研究组试剂与溶液：HAuCL4(进口，sigma)，BSA(进口，巴斯夫或sigma)，PEG(20000)，二氯二甲硅烷+氯仿，各种普通化学药品，表面活性剂，缓冲溶液若干。标准品：叶锈菌孢子(浓度：1000ppm)菌种来源：主要材料仪器：划膜仪(biodot XYZ3060)；胶体金颗粒(北京勤邦生物技术有限公司)；电磁加热搅拌套式恒温本文档来自技高网...

【技术保护点】
抗小麦叶锈菌的单克隆抗体，由保藏号为CGMCC No.10884的杂交瘤细胞所分泌。

【技术特征摘要】
1.抗小麦叶锈菌的单克隆抗体，由保藏号为CGMCC No.10884的杂交瘤细胞所分泌。
2.分泌抗小麦叶锈菌的单克隆抗体的杂交瘤细胞株，其保藏号为CGMCC No.10884。
3.用于检测小麦叶锈的胶体金试纸条，包括样品垫、金标垫、NC膜、吸水纸和PS底板；
所述样品垫、金标垫、NC膜和吸水纸按样品层析方向依次设置于PS底板上；
其特征在于：所述金标垫上包被有胶体金标记的权利要求1所述的的单克隆抗体；
所述NC膜上按样品层析方向依次包括检测线和质控线，所述检测线上包被有小麦叶锈
菌抗原蛋白，其氨基酸序列如Seq ID No.1所示；所述质控线上包被有羊抗鼠二抗。
4.根据权利要求3所述的胶体金试纸条，所述金标垫上的抗体包被浓度为0.12ug/...

【专利技术属性】
技术研发人员：高利，蔚慧欣，沈慧敏，刘太国，刘博，陈万权，
申请(专利权)人：中国农业科学院植物保护研究所，
类型：发明
国别省市：北京;11