乳腺癌易感基因检测试剂盒制造技术

本发明专利技术提供一种乳腺癌易感基因检测试剂盒。本发明专利技术的乳腺癌易感基因检测试剂盒包含12组用于PCR扩增乳腺癌易感基因BRCA1和BRCA2的突变热点的引物组，能够使对上述乳腺癌易感基因的PCR扩增效率基本相同，从而能够使以所述PCR扩增产物作为希望测序的DNA片段的二代测序最终获得的针对上述突变热点的测序数据具有良好的均一性。

Breast cancer susceptibility gene detection kit

The present invention provides a breast cancer susceptibility gene detection kit. The invention of the breast cancer susceptibility gene detection kit contains 12 groups of primers for mutation hotspot group PCR amplified breast cancer susceptibility genes BRCA1 and BRCA2, can make the breast cancer susceptibility gene PCR amplification efficiency is basically the same, which can make the PCR amplification product as the sequencing of the DNA fragment of hope the two generation sequencing finally obtained the mutation sequencing data has good uniformity.

【技术实现步骤摘要】
乳腺癌易感基因检测试剂盒
具体而言，本专利技术涉及用于检测乳腺癌易感基因BRCA1和BRCA2的突变的二代测序DNA文库构建方法及检测试剂盒。
技术介绍
乳腺癌是一种严重威胁女性健康的恶性肿瘤，其死亡率仅次于肺癌而位居第二位。在我国的许多大中城市，乳腺癌已占妇女恶性肿瘤死因的首位，严重威胁着女性健康。早诊断早发现，乳腺癌病情的治愈还是相当乐观的。在第Ⅳ期得到诊断的乳腺癌患者只有20％能够存活到5年之后，而在第Ⅰ期就诊的患者100％活到5年之后。因此乳腺癌的早期诊断是目前亟待解决的问题。BRCA(breastcancersusceptibilitygene)是遗传性乳腺癌和卵巢癌的易感基因，其与乳腺癌密切相关。自BRCA1和BRCA2基因成功地定位、分离后，国内外学者对其进行了广泛、深入的研究。BRCA1和BRCA2为乳腺癌遗传性主要的风险因子。二者都是抑癌基因，均呈常染色体显性遗传，且容易引发早年发病。BRCA1基因定位于17q21，编码BRCA1蛋白含1863个氨基酸，在维持细胞正常增殖、分化中发挥重要作用，并参与DNA损伤修复功能，是第1个被证实和克隆的BRCA。BRCA1基因突变会引发DNA修复功能障碍，使细胞代谢和增殖紊乱，促进细胞恶变和肿瘤发生。BRCA2基因位于13q12，编码BRCA2蛋白含3418个氨基酸，对细胞生长的调节有重要作用。BRCA2变异范围达整个基因的编码区，目前尚未发现非编码区的变异。BRCA2基因发生突变后表达的蛋白质失去了修复DNA损伤的功能，导致染色体不稳定，促进肿瘤发生。总之，BRCA1和BRCA2突变、功能缺失，造成基因不稳定，逃避集体防御体系监视，使细胞非控制性增殖，导致肿瘤的发生[1]。有研究表明，有5％～10％的乳腺癌和10％～15％的卵巢癌是由BRCA1/2突变引起的，而在乳腺癌和卵巢癌高发家族中80％的患者BRCA1/2基因存在突变。与正常女性相比，携带BRCA1或BRCA2基因突变的女性，患乳腺癌或卵巢癌的风险高5-20倍，一生中可能有45％-65％的概率患乳腺癌，11％-40％的概率患卵巢癌，且易早年发病[2,3]。据报道，乳腺癌的BRCA1和BRCA2基因检测方法有很多，OzcelikH等曾利用Long-rangePCR扩增BRCA1和BRCA2两个基因全基因，设计17对引物，采用invitrogen公司的SequalPrepLongPCR体系扩增，由于扩增片段长度太长，引物设计区域不恰当，导致出现扩增产物中非特异带型较多，干扰BRCA1和BRCA2目标区域富集[4]。利用多重PCR技术将BRCA1和BRCA2外显子区域扩增富集，需设计几十到几百对引物分到不同PCR体系中[5-7]。同样地，扩增片段、引物设计、退火温度和延伸时间优化不恰当，会导致非特异性条带的增多，可能有十几对引物混合在一个反应中，经常会导致交互配对或增加错配产物，影响目标区域扩增效率及产物量，最终导致测序数据均一性差，非特异序列占比多。因此本领域迫切需要建立新的乳腺癌易感基因BRCA1和BRCA2检测技术。通过对样本的BRCA1和BRCA2的高通量单重PCR扩增富集技术，可更全面准确的评估患乳腺癌的风险。能够早期客观、灵敏和稳定的检测BRCA1和BRCA2基因突变，以便进行及时、有针对性的治疗或预防乳腺癌，降低医疗成本，节约社会资源。参考文献非专利文献[1]登云特,王国平.乳腺癌易感基因BRCA1/2的研究进展[J/CN].中国乳腺病杂志:电子版,2013,7(5):374-378.[2]黄清丰,李茹捧,付倩,吕晶,张兰.基因导向的乳腺癌治疗进展研究[J].中国医药指南.2014,12(6):39.[3]AntoniouA,PharoahPD,NarodS,etal.AveragerisksofbreastandovariancancerassociatedwithBRCA1orBRCA2mutationsdetectedincaseseriesunselectedforfamilyhistory:Acombinedanalysisof22studies.AmJHumGenet,2003,72:1117-1130.[4]OzcelikH,ShiX,ChangMC,etal.Long-rangePCRandnext-generationsequencingofBRCA1andBRCA2inbreastcancer.JMolDiagn.2012,14:467–475.[5]TarabeuxJ,ZeitouniB,MoncoutierV,etal.StreamlinediontorrentPGM-baseddiagnostics:BRCA1andBRCA2genesasamodel[J].EuropeanJournalofHumanGenetics,2014,22(4):535-541.[6]MinucciA,ScambiaG,SantonocitoC,etal.ClinicalimpactonovariancancerpatientsofmassiveparallelsequencingforBRCAmutationdetection:theexperienceatGemellihospitalandaliteraturereview[J].Expertreviewofmoleculardiagnostics,2015:1-21.[7]EllisonG,HuangS,CarrH,etal.AreliablemethodforthedetectionofBRCA1andBRCA2mutationsinfixedtumourtissueutilisingmultiplexPCR-basedtargetednextgenerationsequencing[J].BMCclinicalpathology,2015,15(1):5.
技术实现思路
一种可行的策略是，对于BRCA1/2中的突变热点，分别设计引物并在独立的PCR反应体系中以同一PCR反应条件将它们分别扩增出来。但是，在这种策略下，如何设计引物使得各突变热点在同一PCR反应条件下的扩增效率基本一致、从而使最终获得的测序数据具有良好的均一性，且不产生非特异产物，成为最大的难点。本专利技术的目的在于提供：能够在同一PCR反应条件下、以基本一致的扩增效率扩增乳腺癌易感基因BRCA1和BRCA2的三个突变热点的扩增试剂盒以及PCR扩增乳腺癌易感基因BRCA1和BRCA2的突变热点的方法；使最终获得的对于这些突变热点的测序数据具有良好均一性的、构建用于检测乳腺癌易感基因BRCA1和BRCA2的突变的二代测序DNA文库的方法；以及用于检测乳腺癌易感基因BRCA1和BRCA2的突变的试剂盒。本专利技术人为解决上述问题进行了深入研究，结果发现，通过使用特定的PCR扩增引物，可以在同一PCR反应程序中同时扩增乳腺癌易感基因BRCA1和BRCA2的三个突变热点，并达到基本一致的扩增效率，进而使得最终获得的对于这些突变热点的测序数据具有良好均一性，从而完成了本专利技术。即，本专利技术包括：1.一种构建用于检测乳腺癌易感基因BRCA1和BRCA2的突变的二本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种构建用于检测乳腺癌易感基因BRCA1和BRCA2的突变的二代测序DNA文库的方法，其包括：步骤A：分别以等摩尔量的人基因组DNA作为模板，使用等摩尔量的下述引物组，在同一PCR反应条件下，扩增人基因组DNA片段；步骤B：以扩增得到的人基因组DNA片段的混合物作为希望进行测序的DNA片段，构建二代测序DNA文库；其中，所述引物组为：引物组1：核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示的上游引物及核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示的下游引物；引物组2：核苷酸序列如SEQ ID NO：3所示的上游引物及核苷酸序列如SEQ ID NO：4所示的下游引物；引物组3：核苷酸序列如SEQ ID NO：5所示的上游引物及核苷酸序列如SEQ ID NO：6所示的下游引物；以及引物组4：核苷酸序列如SEQ ID NO：7所示的上游引物及核苷酸序列如SEQ ID NO：8所示的下游引物；引物组5：核苷酸序列如SEQ ID NO：9所示的上游引物及核苷酸序列如SEQ ID NO：10所示的下游引物；引物组6：核苷酸序列如SEQ ID NO：11所示的上游引物及核苷酸序列如SEQ ID NO：12所示的下游引物；引物组7：核苷酸序列如SEQ ID NO：13所示的上游引物及核苷酸序列如SEQ ID NO：14所示的下游引物；引物组8：核苷酸序列如SEQ ID NO：15所示的上游引物及核苷酸序列如SEQ ID NO：16所示的下游引物；引物组9：核苷酸序列如SEQ ID NO：17所示的上游引物及核苷酸序列如SEQ ID NO：18所示的下游引物；引物组10：核苷酸序列如SEQ ID NO：19所示的上游引物及核苷酸序列如SEQ ID NO：20所示的下游引物；引物组11：核苷酸序列如SEQ ID NO：21所示的上游引物及核苷酸序列如SEQ ID NO：22所示的下游引物；以及引物组12：核苷酸序列如SEQ ID NO：23所示的上游引物及核苷酸序列如SEQ ID NO：24所示的下游引物；所述PCR反应条件的变性温度为95℃，退火温度为56℃。...

【技术特征摘要】
1.一种构建用于检测乳腺癌易感基因BRCA1和BRCA2的突变的二代测序DNA文库的方法，其包括：步骤A：分别以等摩尔量的人基因组DNA作为模板，使用等摩尔量的下述引物组，在同一PCR反应条件下，扩增人基因组DNA片段；步骤B：以扩增得到的人基因组DNA片段的混合物作为希望进行测序的DNA片段，构建二代测序DNA文库；其中，所述引物组为：引物组1：核苷酸序列如SEQIDNO：1所示的上游引物及核苷酸序列如SEQIDNO：2所示的下游引物；引物组2：核苷酸序列如SEQIDNO：3所示的上游引物及核苷酸序列如SEQIDNO：4所示的下游引物；引物组3：核苷酸序列如SEQIDNO：5所示的上游引物及核苷酸序列如SEQIDNO：6所示的下游引物；以及引物组4：核苷酸序列如SEQIDNO：7所示的上游引物及核苷酸序列如SEQIDNO：8所示的下游引物；引物组5：核苷酸序列如SEQIDNO：9所示的上游引物及核苷酸序列如SEQIDNO：10所示的下游引物；引物组6：核苷酸序列如SEQIDNO：11所示的上游引物及核苷酸序列如SEQIDNO：12所示的下游引物；引物组7：核苷酸序列如SEQIDNO：13所示的上游引物及核苷酸序列如SEQIDNO：14所示的下游引物；引物组8：核苷酸序列如SEQIDNO：15所示的上游引物及核苷酸序列如SEQIDNO：16所示的下游引物；引物组9：核苷酸序列如SEQIDNO：17所示的上游引物及核苷酸序列如SEQIDNO：18所示的下游引物；引物组10：核苷酸序列如SEQIDNO：19所示的上游引物及核苷酸序列如SEQIDNO：20所示的下游引物；引物组11：核苷酸序列如SEQIDNO：21所示的上游引物及核苷酸序列如SEQIDNO：22所示的下游引物；以及引物组12：核苷酸序列如SEQIDNO：23所示的上游引物及核苷酸序列如SEQIDNO：24所示的下游引物；所述PCR反应条件的变性温度为95℃，退火温度为56℃。2.根据权利要求1所述的方法，其中，所述PCR反应条件的延伸温度为72℃。3.根据权利要求1或2中任一项所述的方法，其中，所述模板在进入该PCR反应的温度循环前在95℃进行了3分钟的预变性。4.根据权利要求1所述的方法，其中，所述步骤B包括：步骤B-1：将所述人基因组DNA片段进行末端修复，得到平末端的DNA片段；步骤B-2：将所述平末端的DNA片段进行3'端加A，得到3'端加A的DNA片段；步骤B-3：将所述3'端加A的DNA片段进行加接头，得到加接头DNA片段；以及步骤B-4：将所述加接头DNA片段进行PCR扩增，得到扩增产物。5.根据权利要求4所述的方法，其中，所述步骤B还包括：在所述步骤B-4之后进行的步骤B-5：从所述扩增产物中纯化回收具有目的大小的片段。6.根据权利要求4所述的方法，其中，在所述步骤B-1与所述步骤B-2之间、所述步骤B-2与所述步骤B-3之间以及所述步骤B-3与所述步骤B-4之间，还包括纯化步骤。7.一种用于检测乳腺癌易感基因BRCA1和BRCA2的突变的试剂盒，其包括：用于PCR扩增乳腺癌易感基因BRCA1和BRCA2的片段的试剂；用于构建二代测序DNA文库的试剂；和用于对二代测序DNA文库进行上机测序的试剂；其中，所述用于PCR扩增乳腺癌易感基因BRCA1和BRCA2的片段的试剂包括下述引物组1～12：引物组1：核苷酸序列如SEQIDNO：1所示的上游引物及核苷酸序列如SEQIDNO：2所示的下游引物；引物组2：核苷酸序列如SEQIDNO：3所示的上游引物及核苷酸序列如SEQIDNO：4所示的下游引物；引物组3：核苷酸序列如SEQIDNO：5所示的上游引物及核苷酸序列如SEQIDNO：6所示的下游引物；以及引物组4：核苷酸序列如SEQIDNO：7所示的上游引物及核苷酸序列如SEQIDNO：8所示的下游引物；引物组5：核苷酸序列如SEQIDNO：9所示的上游引物及核...

【专利技术属性】
技术研发人员：王秀莉，王旺，玄兆伶，李大为，梁峻彬，陈重建，
申请(专利权)人：安诺优达基因科技北京有限公司，
类型：发明
国别省市：北京,11