一种低成本的PML/RARA融合基因快速检测探针及其制备方法和应用技术

本发明专利技术属于分子生物学领域，具体涉及一种低成本的PML/RARA融合基因快速检测探针及其制备方法。所述制备方法包括以下步骤：从UCSC Genome Browser下载PML和RARA基因探针所覆盖区域基因组非重复序列，再将分割后的序列批量导入OligoArray软件进行探针设计，然后将设计后的探针加上标签序列后直接合成，再使用带有荧光基团的标签引物对探针进行扩增和标记，得到PML/RARA融合基因快速检测探针。本发明专利技术制备所得PML/RARA融合基因快速检测探针具有杂交时间短(可在15～30分钟完成杂交实验)、杂交信号明亮、信噪比高、制备成本低等优点。

Low cost PML/RARA fusion gene quick detection probe, preparation method and application thereof

The invention belongs to the field of molecular biology, in particular to a low cost PML/RARA fusion gene fast detection probe and a preparation method thereof. The preparation method comprises the following steps: from UCSC Genome Browser download PML and RARA gene probe area covered by the genome of non repetitive sequences, then the sequence batch split after the import OligoArray software for probe design, then probe after the design of the tag sequence after direct synthesis, with the use of fluorescent tag primer the probe was then amplified and labeled, PML/RARA fusion gene detecting probe. The PML/RARA fusion gene quick detection probe prepared by the invention has the advantages of short hybridization time (can complete hybridization experiments in 15~30 minutes), bright hybridization signal, high signal to noise ratio, low preparation cost, etc..

【技术实现步骤摘要】
一种低成本的PML/RARA融合基因快速检测探针及其制备方法和应用
本专利技术属于分子生物学领域，具体涉及一种低成本的PML/RARA融合基因快速检测探针及其制备方法和应用。
技术介绍
检测PML/RARA融合基因是诊断急性早幼粒细胞白血病(APL)最特异最敏感的方法之一，也是APL治疗方案选择、疗效分析预后分析等最可靠的指标。目前核型分析、PCR法和FISH法是常见的几种检测方式。FISH具有安全、快速、灵敏度高及同时显示多种颜色等优点。荧光原位杂交是一种在20世纪80年代放射性原位杂交技术基础上发展起来的一种非放射性分子遗传技术，以荧光素标记取代放射性同位素标记而形成的一种新的原位杂交方法。目前FISH常用的检测探针主要是通过对特定人类基因组BAC克隆进行缺口平移法或随机引物法标记，再经COT-1DNA封闭后用于原位杂交实验，但此方法包含大量的重复序列即使经过COT-1DNA封闭但杂交结果仍具有较高的背景，并且此种方法标记的探针通常需要12-16h(过夜)来完成杂交实验费时费力并且此种方需要大量(通常是探针浓度的50～100倍)昂贵的COT-1DNA来进行重复序列封阻，这大大的增加了探针的制备成本。此外近年来一种不含重复序列的快速荧光原位杂交探针的制备方法也被建立起来(1h完成杂交实验)，但此种方法需要设计大量引物或者构建大量载体来实现探针的制备，并且探针的制备过程仍采用缺口平移或随机引物等传统方法，导致批次间的不稳定；此外此种制备方法仍然需要依赖于人类基因组序列或者BAC克隆序列，原料来源具有一定局限性，并且整个制备过程繁琐，制备成本和不可控因素大大增加。
技术实现思路
本专利技术针对现有技术的不足，目的在于提供一种低成本的PML/RARA融合基因快速检测探针及其制备方法和应用。为实现上述专利技术目的，本专利技术采用的技术方案为：一种低成本的PML/RARA融合基因快速检测探针的制备方法，包括如下步骤：(1)从UCSCGenomeBrowser下载PML和RARA基因探针所覆盖区域的基因组非重复序列，其中PML探针覆盖区域为：chr1574089693～74634008，RARA探针覆盖区域为：chr1738059674～38977709；(2)将步骤(1)获得的PML基因探针所覆盖区域的基因组非重复序列使用perl插件程序chunks.pl分割成1kb大小的区块；将分割后的区块批量导入OligoArray软件进行探针设计、探针筛选，然后将筛选出的探针导出到EXCEL表格中，再分别在每条探针的5’端和3’端加上18bp的标签序列，得到一系列带有标签序列的PML探针序列；(3)将步骤(1)获得的RARA基因探针所覆盖区域的基因组非重复序列使用perl插件程序chunks.pl分割成1kb大小的区块；将分割后的区块批量导入OligoArray软件进行探针设计、探针筛选，然后将筛选出的探针导出到EXCEL表格中，再分别在每条探针的5’端和3’端加上18bp的标签序列，得到一系列带有标签序列的RARA探针序列；(4)使用DNA合成仪对步骤(2)所得带有标签序列的PML探针序列进行化学合成，将化学合成的探针进行混合，制备得到PML探针库；同理，使用DNA合成仪对步骤(3)所得带有标签系列的RARA探针序列进行化学合成，将化学合成的探针进行混合，制备得到RARA探针库；(5)分别合成5’端带有绿色荧光基团的M13通用引物和5’端带有橘红色荧光基团的M13通用引物，使用5’端带有绿色荧光基团的M13通用引物对PML探针库进行扩增标记反应，使用5’端带有橘红的荧光基团的M13通用引物对RARA探针库进行扩增标记反应；(6)步骤(5)所得PML探针库的扩增标记产物经纯化、稀释后得到荧光标记的PML探针库，步骤(5)所得RARA探针库的扩增标记产物经纯化、稀释后得到荧光标记的RARA探针库，所述荧光标记的PML探针库和荧光标记的RARA探针库构成了PML/RARA融合基因快速检测探针。上述方案中，步骤(2)和步骤(3)中所述探针筛选的条件为：探针长度50bp，TM值85～99℃，GC比40～80％，不含TTTT/GGGG/AAAA/CCCC，探针间最小间隔5bp。上述方案中，步骤(2)和步骤(3)中所述标签序列的碱基序列如下所示：5’端标签序列为：TGTAAAACGACGGCCAG(M13上游序列)3’端标签序列为：GGTCATAGCTGTTTCCTG(M13下游序列)。上述方案中，步骤(5)中所述通用引物序列为：M13-FTGTAAAACGACGGCCAGT；M13-RCAGGAAACAGCTATGACC。上述方案中，步骤(5)所述扩增标记反应的PCR反应体系如下：上述方案中，步骤(5)所述扩增标记反应的PCR反应条件如下：95℃5min；94℃30s，58℃30s，72℃30s，共进行35个循环；72℃10min。包含上述制备方法制备所得PML/RARA融合基因快速检测探针的试剂盒。上述试剂盒在制备检测PML/RARA融合基因试产品中的应用，具体的应用方式包括如下步骤：(1)样本处理：将外周血细胞滴片样本放入盛有2×SSC的容器中，微波炉高火加热处理3min直至液体沸腾，然后再中低火继续加热处理10min，处理完成后立即将玻片置于-20℃预冷的梯度酒精中脱水晾干，备用；(2)PML/RARA融合基因快速检测探针杂交混合物的制备：将荧光标记的PML探针库、荧光标记的RARA探针库和杂交缓冲液按照1:1:9的体积比混合；(3)探针样本共変性：每例样本使用10μL步骤(2)混合所得PML/RARA融合基因快速检测探针杂交混合物，使用22×22mm盖玻片盖片，使用橡皮胶封片，封片后将玻片置于杂交仪中90℃变性1min，37℃杂交15～30min；(4)杂交后洗涤：待杂交完成后揭去盖玻片，将玻片置于60℃预热的洗液中洗涤去除未结合探针；(5)复染及镜检：将晾干的玻片滴加10μL抗淬灭封片剂封片，然后在荧光显微镜下观察杂交结果。上述方案中，步骤(2)中所述杂交缓冲液的组分为：10wt％去离子甲酰胺、20wt％硫酸葡聚糖、1μg/mLRNaseA、0.6M氯化钠、10mM柠檬酸缓冲液。上述方案中，步骤(3)中所述洗液含0.3M氯化钠、0.03M柠檬酸钠和0.1％Tween-20。本专利技术的有益效果如下：(1)相比于传统的BAC克隆FISH，本专利技术所述制备方法完全不依赖BAC克隆，且不含有重复序列，不需要昂贵的COT-1DNA进行封闭，大大降低了杂交背景和制备成本。(2)相比于近年来建立的不含重复序列的快速荧光原位杂交探针的制备方法，本专利技术所述制备方法中，探针的筛选主要依赖程序完成，并且使用的是更为稳定的PCR法扩增和标记探针，探针标记率更高更均一，仅在探针5’端进行荧光标记所以不影响探针的杂交配对反应；此外本专利技术不采用容易受环境或操作手法影响的缺口平移反应和随机引物反应来标记探针，所标记的探针长短一致，增加了批次间的稳定性；(3)与现有技术相比，本专利技术通过优化探针设计配合特定的杂交缓冲液以及独特的检测方法，本专利技术可在15-30min内完成杂交实验，这比现有技术中最快需要1h来完成杂交实验所耗费的时间相比，降低了50％以上。(4)本发本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种低成本PML/RARA融合基因快速检测探针的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：(1)从UCSC Genome Browser下载PML和RARA基因探针所覆盖区域的基因组非重复序列，其中PML探针覆盖区域为：chr15 74089693～74634008，RARA探针覆盖区域为：chr1738059674～38977709；(2)将步骤(1)获得的PML基因探针所覆盖区域的基因组非重复序列使用perl插件程序chunks.pl分割成1kb大小的区块；将分割后的区块批量导入OligoArray软件进行探针设计、探针筛选，然后将筛选出的探针导出到EXCEL表格中，再分别在每条探针的5’端和3’端加上18bp的标签序列，得到一系列带有标签序列的PML探针序列；(3)将步骤(1)获得的RARA基因探针所覆盖区域的基因组非重复序列使用perl插件程序chunks.pl分割成1kb大小的区块；将分割后的区块批量导入OligoArray软件进行探针设计、探针筛选，然后将筛选出的探针导出到EXCEL表格中，再分别在每条探针的5’端和3’端加上18bp的标签序列，得到一系列带有标签系列的RARA探针序列；(4)使用DNA合成仪对步骤(2)所得带有标签序列的PML探针序列进行化学合成，将化学合成的探针进行混合，制备得到PML探针库；同理，使用DNA合成仪对步骤(3)所得带有标签系列的RARA探针序列进行化学合成，将化学合成的探针进行混合，制备得到RARA探针库；(5)分别合成5’端带有绿色荧光基团的M13通用引物和5’端带有橘红色荧光基团的M13通用引物，使用5’端带有绿色荧光基团的M13通用引物对PML探针库进行扩增标记反应，使用5’端带有橘红的荧光基团的M13通用引物对RARA探针库进行扩增标记反应；(6)将步骤(5)所得PML探针库的扩增标记产物纯化、稀释后即得到荧光标记的PML探针库，将步骤(5)所得RARA探针库的扩增标记产物纯化、稀释后即得到荧光标记的RARA探针库，所述荧光标记的PML探针库和荧光标记的RARA探针库构成了PML/RARA融合基因快速检测探针。...

【技术特征摘要】
1.一种低成本PML/RARA融合基因快速检测探针的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：(1)从UCSCGenomeBrowser下载PML和RARA基因探针所覆盖区域的基因组非重复序列，其中PML探针覆盖区域为：chr1574089693～74634008，RARA探针覆盖区域为：chr1738059674～38977709；(2)将步骤(1)获得的PML基因探针所覆盖区域的基因组非重复序列使用perl插件程序chunks.pl分割成1kb大小的区块；将分割后的区块批量导入OligoArray软件进行探针设计、探针筛选，然后将筛选出的探针导出到EXCEL表格中，再分别在每条探针的5’端和3’端加上18bp的标签序列，得到一系列带有标签序列的PML探针序列；(3)将步骤(1)获得的RARA基因探针所覆盖区域的基因组非重复序列使用perl插件程序chunks.pl分割成1kb大小的区块；将分割后的区块批量导入OligoArray软件进行探针设计、探针筛选，然后将筛选出的探针导出到EXCEL表格中，再分别在每条探针的5’端和3’端加上18bp的标签序列，得到一系列带有标签系列的RARA探针序列；(4)使用DNA合成仪对步骤(2)所得带有标签序列的PML探针序列进行化学合成，将化学合成的探针进行混合，制备得到PML探针库；同理，使用DNA合成仪对步骤(3)所得带有标签系列的RARA探针序列进行化学合成，将化学合成的探针进行混合，制备得到RARA探针库；(5)分别合成5’端带有绿色荧光基团的M13通用引物和5’端带有橘红色荧光基团的M13通用引物，使用5’端带有绿色荧光基团的M13通用引物对PML探针库进行扩增标记反应，使用5’端带有橘红的荧光基团的M13通用引物对RARA探针库进行扩增标记反应；(6)将步骤(5)所得PML探针库的扩增标记产物纯化、稀释后即得到荧光标记的PML探针库，将步骤(5)所得RARA探针库的扩增标记产物纯化、稀释后即得到荧光标记的RARA探针库，所述荧光标记的PML探针库和荧光标记的RARA探针库构成了PML/RARA融合基因快速检测探针。2.根据权利要求1所述制备方法，其特征在于，步骤(2)和步骤(3)中所述探针筛选的条件为：探针长度50bp，TM值85～99℃，GC比40～80％，不含...

【专利技术属性】
技术研发人员：晏星，李雪梅，叶伦，程宏夏，陈刚，
申请(专利权)人：武汉康录生物技术股份有限公司，
类型：发明
国别省市：湖北,42