原位荧光环介导恒温核酸扩增技术检测结核分枝杆菌的方法及试剂盒技术

本发明专利技术公开了一种原位荧光环介导恒温核酸扩增技术检测结核分枝杆菌的方法及试剂盒。本发明专利技术根据结核分枝杆菌ｇｙｒＢ基因保守区设计了四条特异性引物，应用这四条引物，同时结合原位荧光环介导恒温核酸扩增技术，能特异性地检测出结核分枝杆菌。本发明专利技术实现样品原位检测、无需增菌、特异性高，能在不到２小时完成扩增，最低检测极限达到１０ＣＦＵ／ｍｌ，标本的检出率达到９９％。使用本发明专利技术所述的方法和试剂盒鉴定结核分支杆菌简便。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及微生物检测试剂与方法，具体涉及一种原位荧光环介导恒温核酸扩增 技术检测结核分枝杆菌的方法及试剂盒。
技术介绍
目前，结核病是当今世界传染病中的头号杀手，是单因致死率最高的传染性疾病， 其主要致病菌为结核分枝杆菌。据世界卫生组织统计，全世界现有结核病人2000万，每年 新发生约900万例，每年死亡300万人，约1/3人群有潜伏性结核分枝杆菌感染。由于人口 剧增、移民增加、旅游业发展、耐药性的产生、人类免疫缺陷病毒感染流行、吸毒、酗酒与贫 困等原因，结核病呈日益严重回升趋势。我国的结核病疫情相当严峻，耐多药结核病、艾滋 病合并非结核分支杆菌病的发病呈逐年上升趋势。结核分枝杆菌的大面积出现主要是不合 理用药所致，其主要原因是多重耐药结核菌的流行以及人类免疫缺陷病毒感染、器官移植、 免疫抑制剂使用等所致免疫损害宿主增多和高龄人口中机体免疫力低下等因素，使结核分 枝杆菌感染难以控制。为了进一步提高结核病的诊断、治疗和预防控制水平，现在迫切需要 更为精确快速的诊断新技术用于临床鉴定结核分枝杆菌。近年来，有大量的报道证实基于PCR的方法已经成功用于检测结核分枝杆菌，PCR 方法在操作时间上以及检测的特异性和灵敏度方面较常规方法有较大提高，但是，PCR方法 必须有精密的温度循环装置，而且它的检测时间也还是比较长(4 8小时)，并且反应过程 很容易受污染物的影响，从而使得这种方法不能满足实地检测的需要。因此，需要开发一种 灵敏度高并且反应迅速的方法，在一定程度上可以取代PCR检测方法。除了 PCR方法以外， 还有其他核酸扩增方法，比如核酸序列扩增法(NASBA)、自序列复制法(3SR)和链置换复制 法(SDA)。这三种方法的检测水平都不少于10个拷贝，耗时1小时左右就可以将目标核酸 扩增到相似的范围内，尽管如此，它们对目标序列的扩增特异性不强，使得扩增后还需要 详尽的实验操作手段来检测扩增产物。免疫学检测技术快速简便成本低廉，但要求高质量 高稳定性的单克隆抗体，否则因准确性不够，目前只能是辅助检测手段。所以，将生物技术 发展的最新成果应用于病原微生物检测，具有重要意义。DNA 环介导恒温核酸扩增技术(loop-mediated isothermal amplification of DNA, LAMP)克服以往基因扩增方法的不足，在等温条件下能够特异性、高效、快速地进行核 酸的扩增，具有很多的优越性，见文献Notomi T，Okayama H, Masubuchi H, Yonekawa T, Watanabe K,Amino N,Hase Τ. Loop-mediated isothermal amplification of DNA,Nucleic Acids Res. 2000 Jun 15 ；28(12) :E63.。该方法通常是按如下步骤进行步骤一、对被检标 本进行预处理，快速提取被检标本的DNA或RNA ；步骤二、特异性引物的制备确定待测标本 的靶基因后，取得特异性引物2对，内引物和外引物各一对；步骤三、进行环介导等温扩增 技术(LAMP)反应将经前处理的样品、引物、反应缓冲液与Bst DNA聚合酶混合，在63 65°C保温0. 5至1. 5小时进行循环链置换反应；步骤四、分析判断反应产物结果。虽然已公4开的LAMP技术具有高灵敏性，能在等温条件下高效地扩增核酸，但是现有技术也有不足之 处，主要是(1)特殊引物要求极为苛刻，限制该方法的广泛应用；(2)需要对细胞或组织破 碎以提取DNA或RNA，不能够直接对细胞或组织中的病毒或基因进行定位；(3)为了满足扩 增所需要的DNA量，必须增殖病原菌的数量；(4)仅凭反应生成的乳白色沉淀物判断结果， 不够清楚准确，也不易实现反应小型化，限制其进一步发展。为了克服这些缺点有必要对现 有的LAMP技术进行改进。
技术实现思路
本专利技术的首要目的在于克服现有技术的不足之处和缺陷，提供一种原位荧光环介 导恒温核酸扩增技术检测结核分枝杆菌的方法。本专利技术的另一目的在于提供实现上述方法的试剂盒。本专利技术的目的通过下述技术方案实现一种原位荧光环介导恒温核酸扩增技术检 测结核分枝杆菌的方法，包括以下步骤(1)设计引物设计外引物1对和内引物1对，具体为外引物1 :5，-CAGCACGCTAATTACCCGG-3，；外弓I物2 :5，-CGAGTTTGGTCATCAGCCG-3，；内引物 1 :5，-TGGTCGTAGTAGGTCGATGGGGAGTCGATCTGCACACAGCT-3，；内引物 2 :5，-Cy3-CTGCGCGATGGCGAACTCAAGGCACCGTAAACACCGTAG-3'；(2)对被检样品进行处理A、将被检样品中的菌体进行固定；B、增加固定后的菌体的细胞壁通透性；(3)环介导等温扩增反应(LAMP)本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种原位荧光环介导恒温核酸扩增技术检测结核分枝杆菌的方法，其特征在于包括以下步骤：　　（１）设计引物：设计外引物１对和内引物１对，具体为：　　外引物１：５’－ＣＡＧＣＡＣＧＣＴＡＡＴＴＡＣＣＣＧＧ－３’；　　外引物２：５’－ＣＧＡＧＴＴＴＧＧＴＣＡＴＣＡＧＣＣＧ－３’；　　内引物１：５’－ＴＧＧＴＣＧＴＡＧＴＡＧＧＴＣＧＡＴＧＧＧＧＡＧＴＣＧＡＴＣＴＧＣＡＣＡＣＡＧＣＴ－３’；　　内引物２：５’－Ｃｙ３－ＣＴＧＣＧＣＧＡＴＧＧＣＧＡＡＣＴＣＡＡＧＧＣＡＣＣＧＴＡＡＡＣＡＣＣＧＴＡＧ－３’；　　（２）对被检样品进行处理：　　Ａ、将被检样品中的菌体进行固定；　　Ｂ、增加固定后的菌体的细胞壁通透性；　　（３）环介导等温扩增反应：　　Ａ、反应体系为：每２５μｌ反应体系含有１０ｐｍｏｌ外引物１、１０ｐｍｏｌ外引物２、１０ｐｍｏｌ内引物１、１０ｐｍｏｌ内引物２、８单位Ｂｓｔ　ＤＮＡ聚合酶和１２．５微升ＬＡＭＰ反应缓冲液，双蒸去离子水补至２５μｌ；　　所述ＬＡＭＰ反应缓冲液为１０ｍＭ　ｄＮＴＰ、１０×ＴｈｅｒｍｏＰｏｌ反应缓冲液、１５０ｍＭＭｇＳＯ↓［４］和５ｍＭ　Ｂｅｔｉｎａ按体积比８∶５∶２∶１０配制；　　Ｂ、反应条件为：将配制好的反应体系滴加到步骤（２）处理好的菌体上，聚酯封层，６３℃恒温反应２ｈ；　　（４）样品复染：反应结束后，用４′，６－二脒基－２－苯基吲哚染色，然后用无菌水中漂洗，晾干；　　（５）分析判断反应产物结果：置于荧光显微镜下观察，打开绿色光，在视野中看到激发红色荧光的细胞就是阳性结果，反之，绿色光激发下看不到的细胞即为阴性结果。...

【技术特征摘要】
一种原位荧光环介导恒温核酸扩增技术检测结核分枝杆菌的方法，其特征在于包括以下步骤(1)设计引物设计外引物1对和内引物1对，具体为外引物15’ CAGCACGCTAATTACCCGG 3’；外引物25’ CGAGTTTGGTCATCAGCCG 3’；内引物15’ TGGTCGTAGTAGGTCGATGGGGAGTCGATCTGCACACAGCT 3’；内引物25’ Cy3 CTGCGCGATGGCGAACTCAAGGCACCGTAAACACCGTAG 3’；(2)对被检样品进行处理A、将被检样品中的菌体进行固定；B、增加固定后的菌体的细胞壁通透性；(3)环介导等温扩增反应A、反应体系为每25μl反应体系含有10pmol外引物1、10pmol外引物2、10pmol内引物1、10pmol内引物2、8单位Bst DNA聚合酶和12.5微升LAMP反应缓冲液，双蒸去离子水补至25μl；所述LAMP反应缓冲液为10mM dNTP、10×ThermoPol反应缓冲液、150mMMgSO4和5mM Betina按体积比8∶5∶2∶10配制；B、反应条件为将配制好的反应体系滴加到步骤(2)处理好的菌体上，聚酯封层，63℃恒温反应2h；(4)样品复染反应结束后，用4′，6 二脒基 2 苯基吲哚染色，然后用无菌水中漂洗，晾干；(5)分析判断反应产物结果置于荧光显微镜下观察，打开绿色光，在视野中看到激发红色荧光的细胞就是阳性结果，反之，绿色光激发下看不到的细胞即为阴性结果。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于步骤(2)中所述将被检样品中的菌体进 行固定，是通过以下步骤实现的将待检测样品悬浮于磷酸缓冲液中，1000 1200rpm离心 2 3分钟，取上清；10000 12000rpm离心3 4分钟沉淀上清中的细胞，然后用磷酸缓 冲液冲洗细胞三次；10000 12000rpm离心3 4分钟后，在细胞沉淀中加入体积百分比 4%的多聚甲醛，然后静置过夜；接着10000 12000rpm离心3 4分钟后，将细胞沉淀悬 浮于磷酸缓冲液，得到细胞悬浮液；细胞悬浮液滴加到用质量百分比为0. 03%的多聚赖氨 酸处理过的玻璃板孔中，生物安全柜中自然风干。3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于步骤(2)中所述将增加固定后的菌体 的细胞壁通透性，是通过以下步骤实现的将固定好的细胞分别依次置于体积百分比为 50%、80%、100%浓度的乙醇...

【专利技术属性】
技术研发人员：叶宇鑫，石磊，
申请(专利权)人：华南理工大学，
类型：发明
国别省市：81[中国|广州]