一种用于细胞原位检测小分子化合物进入线粒体的方法技术

本发明专利技术公开了一种用于细胞原位检测小分子化合物进入线粒体的方法，具体为：选用适当的小分子化合物与细胞孵育，在不破坏细胞线粒体的条件下获取具有完整生理结构的线粒体，并收集胞浆；之后用小分子化合物与获取的线粒体进行孵育，将所得孵育小分子化合物后的线粒体及之前收集的胞浆在非变性条件下分别进行裂解以获得线粒体蛋白裂解液和胞浆蛋白裂解液，再结合质谱分析以实现在细胞原位水平上检测小分子化合物是否进入线粒体。采用该方法可以在细胞原位水平上检测小分子化合物是否进入线粒体，并可进一步检测小分子化合物进入线粒体的方式，可直接应用于先导药物的靶区验证或者用于以线粒体为效应器的先导药物的筛选，可靠性高，灵敏度高。

A method for in situ detection of small molecular compounds into mitochondria by cells

The invention discloses a method for in situ detection of small molecules into the mitochondria, in particular: selection of small molecules and cells with appropriate education, obtain the complete physiological structure of the mitochondria in the cells without damaging the mitochondrial conditions, and collect the cytoplasm; then with small molecular compounds were obtained and mitochondria yo, the incubation of cytoplasmic small molecules after mitochondria and previously collected under non denaturing conditions were obtained by cleavage of mitochondrial protein lysate and cytosolic protein lysate, combined with the mass spectrometry analysis to detect whether the small molecules into the mitochondria in the cell in situ level. This method can be used to detect small molecules into the mitochondria in the in situ cell level, and further detection of small molecule into the mitochondria, target validation can be directly applied to lead drugs or for drug screening, leading the effector to mitochondria as high reliability, high sensitivity.

【技术实现步骤摘要】
一种用于细胞原位检测小分子化合物进入线粒体的方法
本专利技术涉及分子药理学领域，具体涉及一种用于细胞原位检测小分子化合物进入线粒体的方法。
技术介绍
线粒体作为细胞内关键的细胞器，不仅具有为细胞供给能量、参与代谢等重要功能，而且参与细胞信号传导和细胞凋亡等重要的生物过程。大量研究表明，线粒体的数量、分布、结构、功能变化与神经退行性病变(如帕金森症、阿尔兹海默症)、代谢型疾病(如II型糖尿病、肥胖症)、癌症及心血管疾病等病症密切相关。线粒体被冠以“细胞信号传导细胞器”和“细胞死亡之马达”等称号，与之相关的“线粒体学”已经成为生命科学和医学等领域的研究热点。在药物作用机理研究过程中，药物通过与靶点相互作用来发挥药效作用，其中线粒体通常是药物发挥作用的主要靶细胞器，因此在细胞原位水平研究小分子化合物是否可以进入线粒体，不仅有助于从分子水平阐述药物的作用机制，同时也为线粒体靶向先导药物的筛选和开发提供新的研究方法。目前，研究小分子化合物定位于线粒体主要是通过与线粒体荧光探针(结合型荧光探针、置换型荧光探针、化学计量型荧光探针)共定位法。其响应机制主要有光致电子转移(PET，photo-inducedelectrontransfer)、分子内电荷转移(ICT，intramolecularchargetransfer)、荧光共振能量转移(FRET，fluorescenceresonanceenerytransfer)等。荧光探针检测法由于其灵敏度高，选择性好适合于实时检测与分子荧光成像。但该类检测方法的使用具有很大的局限性，首先要求化合物具有荧光基团，这对大部分化合物来说都不适用；其次该类检测方法主要基于成像后的共定位分析，容易造成假阳性结果；此外，该方法也不能说明小分子药物进入线粒体的方式。因此，开发一种能在细胞原位水平检测小分子化合物是否进入线粒体及进入线粒体方式的分析方法尤为重要。
技术实现思路
本专利技术要解决的技术问题是提供一种用于细胞原位检测小分子化合物进入线粒体的方法。采用该方法可以在细胞原位水平上检测小分子化合物是否进入线粒体，并可进一步检测小分子化合物进入线粒体的方式，可直接应用于先导药物的靶区验证或者用于以线粒体为效应器的先导药物的筛选，可靠性高，灵敏度高。本专利技术所述的用于细胞原位检测小分子化合物进入线粒体的方法为：选用适当的小分子化合物与细胞孵育，在不破坏细胞线粒体的条件下获取具有完整生理结构的线粒体，并收集胞浆；之后用小分子化合物与获取的线粒体进行孵育，将所得孵育小分子化合物后的线粒体及之前收集的胞浆在非变性条件下分别进行裂解以获得线粒体蛋白裂解液和胞浆蛋白裂解液，再结合质谱分析以实现在细胞原位水平上检测小分子化合物是否进入线粒体。更为具体的方法包括以下步骤：(Ⅰ)选定小分子化合物；(Ⅱ)细胞给药：将选定的小分子化合物与细胞孵育使小分子化合物进入细胞，得到孵育后的细胞；设置对照组；(Ⅲ)线粒体的分离：将孵育后的细胞在不破坏线粒体的条件下用线粒体分离试剂获取具有完整生理结构的线粒体，并收集胞浆；(Ⅳ)药物与线粒体孵育：将选定的小分子化合物与获取的线粒体进行孵育，得到孵育小分子化合物后的线粒体；(Ⅴ)蛋白质的提取：将孵育小分子化合物后的线粒体和之前收集的胞浆在非变性条件下分别进行裂解，分别得到具有完整生理结构蛋白质的线粒体蛋白裂解液和具有完整生理结构蛋白质的胞浆蛋白裂解液；(Ⅵ)质谱分析：将所得的线粒体蛋白裂解液和胞浆蛋白裂解液进行质谱分析，同时与标准样品和对照组样品对比，检测各组线粒体蛋白裂解液和胞浆蛋白裂解液中是否有前述选定的小分子化合物析出，并以此来判断小分子化合物是否进入线粒体中。本专利技术所述的技术方案中，所述的小分子化合物根据体外活性初筛结果进行确定。具体来源可以是目前已经上市的药物，如癌症治疗药物索拉非尼、解热镇痛药阿司匹林、抗高血压药物硝苯地平、抑制胃酸分泌药雷尼替丁等，也可以是自行合成的化合物，或者是天然的化合物。本专利技术所述的技术方案中，所述的细胞为肿瘤细胞株，具体为非小细胞肺癌细胞株NCI-H460。上述方法的步骤(Ⅱ)中，所述小分子化合物与细胞进行孵育的条件与时间与现有技术相同，通常是在37℃培养箱里孵育0.5～5h。本申请中，在孵育时，优选所述小分子化合物在培养液中的浓度为1～10μmol/L。上述方法的步骤(Ⅲ)中，将孵育后的细胞在不破坏线粒体的条件下用线粒体分离试剂获得具有完整生理结构的线粒体的具体操作与现有技术相同。上述方法的步骤(Ⅳ)中，所述小分子化合物与获取的线粒体进行孵育的条件与时间与现有技术相同，通常是在35～37℃条件下孵育0.5～1h。本申请中，在孵育时，优选所述小分子化合物在储存液中的浓度为1～10μmol/L。上述方法的步骤(Ⅴ)中，将孵育小分子化合物后的线粒体和胞浆在非变性条件下进行裂解以分别获得具有完整生理结构蛋白质的线粒体蛋白裂解液和具有完整生理结构蛋白质的胞浆蛋白裂解液的具体操作与现有技术相同。上述方法的步骤(Ⅵ)中，当未经给药细胞提取的线粒体与药物孵育得到的线粒体蛋白裂解液的线粒体蛋白裂解液中能检测到前述选定的小分子化合物析出，则表示该小分子化合物可以直接进入线粒体；当经过单次给药细胞提取的胞浆蛋白裂解液和给药细胞提取的线粒体再次与药物孵育得到的线粒体蛋白裂解液中均有前述选定的小分子化合物析出，且经过单次给药细胞提取的线粒体的蛋白裂解液和未经给药细胞提取的线粒体与药物孵育得到的线粒体蛋白裂解液的线粒体蛋白裂解液中均未检测到前述选定的小分子化合物析出时，则表示该小分子化合物可以间接进入线粒体内。当采用本专利技术所述方法在细胞原位水平检测在非小细胞肺癌细胞株NCI-H460中，小分子化合物是否可以进入线粒体中，具体包括以下步骤：(Ⅰ)选定下述式(A)所示结构的化合物作为小分子化合物：上述式(A)所示结构的小分子化合物可参照公开号为CN104557887A的专利技术专利进行合成，也可自行设计合成路线进行合成。(Ⅱ)细胞给药：将非小细胞肺癌细胞株NCI-H460与式(A)所示结构的小分子化合物进行孵育，使小分子化合物进入细胞，孵育后的非小细胞肺癌细胞株NCI-H460，同时设置对照组；(Ⅲ)线粒体的分离：将孵育后的非小细胞肺癌细胞株NCI-H460在不破坏线粒体的条件下用线粒体分离试剂分离获得具有完整生理结构的线粒体，并收集胞浆；(Ⅳ)药物与线粒体孵育：将式(A)所示结构的小分子化合物与获取的线粒体按现有常规技术进行孵育，得到孵育式(A)所示结构小分子化合物后的线粒体；(Ⅴ)蛋白质的提取：将孵育式(A)所示结构小分子化合物后的线粒体和之前收集的胞浆在非变性条件下分别进行裂解，得到具有完整生理结构蛋白质的线粒体蛋白裂解液和具有完整生理结构蛋白质的胞浆蛋白裂解液；(Ⅵ)质谱分析：将所得的线粒体蛋白裂解液和胞浆蛋白裂解液进行质谱分析，同时与标准样品(小分子化合物纯品)和对照样品(未经给药处理分离提取的线粒体蛋白裂解液和胞浆蛋白裂解液)对比，当未经给药细胞提取的线粒体与药物孵育得到的线粒体蛋白裂解液中能检测到式(A)所示结构的小分子化合物析出，则表示该小分子化合物可以直接进入线粒体；当经过单次给药细胞提取的胞浆蛋白裂解液和给药细胞提取的线粒体再次与药物孵育得到的线本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种用于细胞原位检测小分子化合物进入线粒体的方法，其特征在于：选用适当的小分子化合物与细胞孵育，在不破坏细胞线粒体的条件下获取具有完整生理结构的线粒体，并收集胞浆；之后用小分子化合物与获取的线粒体进行孵育，将所得孵育小分子化合物后的线粒体及之前收集的胞浆在非变性条件下分别进行裂解以获得线粒体蛋白裂解液和胞浆蛋白裂解液，再结合质谱分析以实现在细胞原位水平上检测小分子化合物是否进入线粒体。

【技术特征摘要】
1.一种用于细胞原位检测小分子化合物进入线粒体的方法，其特征在于：选用适当的小分子化合物与细胞孵育，在不破坏细胞线粒体的条件下获取具有完整生理结构的线粒体，并收集胞浆；之后用小分子化合物与获取的线粒体进行孵育，将所得孵育小分子化合物后的线粒体及之前收集的胞浆在非变性条件下分别进行裂解以获得线粒体蛋白裂解液和胞浆蛋白裂解液，再结合质谱分析以实现在细胞原位水平上检测小分子化合物是否进入线粒体。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：具体包括以下步骤：(Ⅰ)选定小分子化合物；(Ⅱ)细胞给药：将选定的小分子化合物与细胞孵育使小分子化合物进入细胞，得到孵育后的细胞；设置对照组；(Ⅲ)线粒体的分离：将孵育后的细胞在不破坏线粒体的条件下用线粒体分离试剂获取具有完整生理结构的线粒体，并收集胞浆；(Ⅳ)药物与线粒体孵育：将选定的小分子化合物与获取的线粒体进行孵育，得到孵育小分子化合物后的线粒体；(Ⅴ)蛋白质的提取：将孵育小分子化合物后的线粒体和之前收集的胞浆在非变性条件下分别进行裂解，分...

【专利技术属性】
技术研发人员：张国海，彭艳，杨阳，李亮萍，曾淑兰，
申请(专利权)人：广西师范大学，
类型：发明
国别省市：广西,45