一种土壤细菌磷组分的液体制造技术

本发明专利技术公开了一种土壤细菌磷组分的液体

A liquid of phosphorus in soil bacteria

The invention discloses a liquid of phosphorus component of soil bacteria

【技术实现步骤摘要】
一种土壤细菌磷组分的液体31PNMR测定方法
本专利技术涉及土壤微生物磷组分的浸提及测定，具体为一种土壤细菌磷组分的液体31PNMR测定方法。
技术介绍
磷是所有有机生命体所必需的营养元素(Cade-Menunetal.,2006)，对植物体而言，磷既是植物体内重要有机化合物的组分，同时又以多种方式参与植物体内各种代谢过程(陆景陵，2005)。植物所需要的磷，多来源于其着生的土壤和外源磷肥的施入。土壤中的磷可分为有机磷和无机磷两大组分，其中有机磷占土壤全磷的50％～80％(Dalal,1977)。土壤中不同的磷化合物形式决定了其水解为无机磷的难易。1980年，Newman和Tate首次将31PNMR技术应用于土壤磷组分测定，目前，液体31PNMR技术在土壤磷组分中的测定应用广泛，可将土壤磷区分为核酸类、磷脂类、肌醇磷酸酯类、磷酸酰胺类、磷蛋白类、磷酸糖类、膦酸酯类等(McKelvie,2005)。土壤微生物磷库是土壤有机磷的重要组成部分，而土壤中微生物磷组分的测定方法较少。目前土壤微生物磷的测定，仅限于用熏蒸法结合钼蓝比色法测定土壤微生物量磷，因此，应用31PNMR技术，建立一种土壤微生物磷组分，特别是土壤细菌磷组分的浸提、测定方法，对于提高对土壤磷组分的认识，明确土壤微生物磷与土壤磷组分的转化关系，有重要的现实意义。
技术实现思路
本专利技术目的在于提供一种土壤细菌磷组分的液体31PNMR测定方法。该方法首先从土壤样品中富集细菌样品，将样品冷冻干燥后浸提，浸提液离心后再次进行冷冻干燥，其后应用液体31PNMR技术进行磷组分测定。本专利技术为分析土壤微生物中磷组分特别是细菌磷组分的组成及含量，提供一种准确、高效的测定方法。本专利技术采用以下技术方案：一种土壤细菌磷组分的液体31PNMR测定方法，它包括以下步骤：(1)土壤细菌样品的获取：a)将采集的土样过2mm筛，通过10-3～10-4梯度稀释后的土壤悬液涂布于LB培养基平板，30℃过夜培养12小时后挑取菌落放置于含5mlLB培养基的试管中，30℃振荡培养至试管浑浊；b)称取1g过筛后的土样加至120ml广口瓶，然后向广口瓶中加入100ml超纯水，于150rpm振荡30min，振荡结束后在8180rpm离心15min，吸取离心上清液至250ml三角瓶，称取1gNaCl、1g蛋白胨和0.5g酵母粉加至三角瓶中，混合均匀后封口120℃灭菌，三角瓶降至室温；取下步骤a)中振荡结束的试管，然后在超净台下酒精灯旁转移其中的菌液至三角瓶中，迅速封口后，30℃振荡培养至三角瓶浑浊后离心，最后将多次离心后富集的细菌样品冷冻干燥得到细菌样品冻干粉末，备用；(2)土壤细菌磷组分的提取：将冻干后的细菌样品称取1.5g于50ml离心管，然后向其中加入30mlNaOH-EDTA溶液，在20℃条件下低速往复振荡16h，浸提液在10000×g下离心30min，吸取上清液再次进行冷冻干燥得到土壤细菌磷组分冻干粉；(3)土壤细菌磷的定量分析：取1ml步骤2)中未冷冻干燥前的上清液加4ml超纯水稀释后，采用ICP-MS测定细菌磷浸提液的全磷含量，用于谱图中量化分析不同磷化合物的含量；(4)土壤细菌磷组分的液体31PNMR测定：将步骤(2)得到的土壤细菌磷组分的冻干粉末称取100mg重溶解于由0.1mLD2O和0.9mL1.0MNaOH与100mMNa2EDTA构成的缓冲液共同组成的混合溶液中，移入5mmNMR测试管中进行谱图测定，仪器采用500M核磁测定，延迟时间2.0s，采集时间0.4s，45度脉冲6μs，化学位移范围为50ppm，扫描次数3万次左右，即可获得土壤细菌磷组分的液体31PNMR谱图。所述步骤(1)b)中离心的具体方法为：首先，直接离心培养后的菌液，离心后取下部沉降物，加15ml用无菌水制备的浓度9‰的NaCl溶液，离心弃去上清液，此过程重复离心清洗四次后，向离心沉降物中加入15ml无菌水，继续离心清洗，弃去上清液，此过程重复三次，最后将离心后富集沉降物即为细菌样品，然后冷冻干燥。所述NaOH-EDTA溶液为0.05M的Na2EDTA溶液和0.25M的NaOH溶液组成。本专利技术的有益效果是：1.本专利技术通过对土壤样品细菌富集培养，浸提并测定其磷组分，得到了土壤微生物磷组分测定的新方法，通过对土壤优势细菌磷组分和土壤磷组分的31PNMR谱图对比，对明确土壤微生物磷在土壤中的转化有重要意义。2.本专利技术通过土壤细菌样品的NaOH-EDTA浸提，增加了浸提液中各磷组分的浸提比例，为获取更详尽的土壤细菌磷组分谱图，了解土壤中的细菌磷组分创造了条件。3.本专利技术通过对细菌样品NaOH-EDTA浸提液的冷冻干燥，富集了细菌磷组分，为获取信噪比更好的土壤细菌磷组分谱图创造了条件。4.本专利技术通过对液体31PNMR测定时相关参数的确定，提高了谱图的分辨率，增加了谱图解析时的准确性。附图说明图1是三种不同土壤优势细菌液体31PNMR谱图。具体实施方式下面结合具体实施例对本专利技术做进一步的详细说明。实施例1土壤优势细菌磷组分的液体31PNMR测定本实施例采用土壤悬液培养富集土壤细菌样品，细菌样品离心冻干后采用NaOH–EDTA浸提离心的方法将细菌中的磷浸提出来，得到细菌磷浸提液；浸提液冷冻干燥处理后，得到粉末样品；将干燥后的粉末用0.1mLD2O和0.9mL含1.0MNaOH和100mMNa2EDTA的缓冲液重溶解后进行31PNMR上机测试，即可得到细菌磷组分的相关信息。具体方法详述如下：(1)土壤细菌样品的获取：a)取褐土秸秆还田后土样，过2mm筛，通过10-3～10-4梯度稀释后的土壤悬液涂布于LB培养基平板，30℃过夜培养12小时后挑取菌落放置于含5mlLB培养基的试管中，30℃振荡培养至试管浑浊；b)称取1g过筛后的土样加至120ml广口瓶，然后向广口瓶中加入100ml超纯水，于150rpm振荡30min，振荡结束后在8180rpm离心15min，吸取离心上清液至250ml三角瓶，称取1gNaCl、1g蛋白胨和0.5g酵母粉加至三角瓶中，混合均匀后封口120℃灭菌，三角瓶降至室温；取下步骤a)中振荡结束的试管，然后在超净台下酒精灯旁转移其中的菌液至三角瓶中，迅速封口后，30℃振荡培养至三角瓶浑浊后离心，最后将多次离心后富集的细菌样品冷冻干燥得到细菌样品冻干粉末，备用；离心的具体方法为：首先，直接离心培养后的菌液，离心后取下部沉降物，加15ml用无菌水制备的浓度9‰的NaCl溶液，离心弃去上清液，此过程重复离心清洗四次后，向离心沉降物中加入15ml无菌水，继续离心清洗，弃去上清液，此过程重复三次，最后将离心后富集沉降物即为细菌样品，然后冷冻干燥。(2)土壤细菌磷组分的提取：将冻干后的细菌样品称取1.5g于50ml离心管，然后向其中加入30mlNaOH-EDTA溶液，在20℃条件下低速往复振荡16h，浸提液在10000×g下离心30min，吸取上清液再次进行冷冻干燥得到土壤细菌磷组分冻干粉；所述NaOH-EDTA溶液为0.05M的Na2EDTA溶液和0.25M的NaOH溶液组成。(3)土壤细菌磷的定量分析：取1ml步骤2)中未冷冻干燥前的上清液加4ml超纯水稀释后，采用ICP-MS测定细菌磷浸提液的全磷含量本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种土壤细菌磷组分的液体

【技术特征摘要】
1.一种土壤细菌磷组分的液体31PNMR测定方法，其特征在于，它包括以下步骤：(1)土壤细菌样品的获取：a)将采集的土样过2mm筛，通过10-3～10-4梯度稀释后的土壤悬液涂布于LB培养基平板，30℃过夜培养12小时后挑取菌落放置于含5mlLB培养基的试管中，30℃振荡培养至试管浑浊；b)称取1g过筛后的土样加至120ml广口瓶，然后向广口瓶中加入100ml超纯水，于150rpm振荡30min，振荡结束后在8180rpm离心15min，吸取离心上清液至250ml三角瓶，称取1gNaCl、1g蛋白胨和0.5g酵母粉加至三角瓶中，混合均匀后封口120℃灭菌，三角瓶降至室温；取下步骤a)中振荡结束的试管，然后在超净台下酒精灯旁转移其中的菌液至三角瓶中，迅速封口后，30℃振荡培养至三角瓶浑浊后离心，最后将多次离心后富集的细菌样品冷冻干燥得到细菌样品冻干粉末，备用；(2)土壤细菌磷组分的提取：将冻干后的细菌样品称取1.5g于50ml离心管，然后向其中加入30mlNaOH-EDTA溶液，在20℃条件下低速往复振荡16h，浸提液在10000×g下离心30min，吸取上清液再次进行冷冻干燥得到土壤细菌磷组分冻干粉；(3)土壤细菌磷的定量分析：取...

【专利技术属性】
技术研发人员：张广娜，林祥杰，郭绍芬，胡青，贾广菊，
申请(专利权)人：临沂大学，
类型：发明
国别省市：山东,37