一种对细胞内端粒酶活性原位成像的纳米探针及其制备方法技术

本发明专利技术涉及一种可对细胞内端粒酶活性进行原位成像检测的纳米探针及其制备方法。纳米探针以金纳米粒子(AuNP)为载体，负载特殊设计的DNA分子信标(MB)。该MB为茎-环结构，并带有一个缺口，将整个DNA序列分为两段：较短的一段是端粒酶引物序列(TSP)；较长的一段(1-MB)含环状结构，其茎部3’端的巯基可共价连接AuNP，5’端修饰荧光分子Cy5。由于荧光共振能量转移，Cy5的荧光被AuNP猝灭，纳米探针的荧光状态为“关”。将探针与细胞温育，探针进入细胞后，在细胞质内端粒酶的作用下，TSP被延长并发生内部链取代，使1-MB环被打开，导致Cy5离开AuNP表面，将荧光状态转换为“开”，进而利用激光共聚焦荧光显微镜观察Cy5的荧光，可实现细胞内端粒酶活性的原位成像分析。该探针可区分肿瘤和正常细胞，还可用于监测细胞内端粒酶活性在端粒酶抑制药物作用下的变化，因此该发明专利技术具有良好的应用前景。

【技术实现步骤摘要】
一、
本专利技术涉及一种可对细胞内端粒酶活性原位成像的纳米探针及其制备方法。二、
技术介绍
人端粒酶是一种核糖核蛋白的复合体，通过其内部的RNA模板，可将长度为六个碱基的DNA重复片段合成到端粒末端。在正常细胞内，端粒的长度随着细胞复制周期的进行而不断缩短，最终导致细胞衰老和凋亡。然而在多种肿瘤细胞中，由于端粒酶的激活，端粒的长度得以维持，导致肿瘤细胞的无限繁殖。肿瘤转移组织中，端粒酶活性通常也是高度表达的。因此，端粒酶被认为是一种很有前景的肿瘤标志物，端粒酶活性的检测对肿瘤的诊断，治疗和监测具有重要的意义。自从1985年端粒酶被发现以来，一大批检测端粒酶活性的方法被提出，主要分为三类:基于聚合酶链反应(PCR)的端粒重复扩增方法(TRAP)，等温DNA扩增或DNA酶方法，以及基于纳米材料的生物传感检测方法。这些方法具有令人满意的灵敏度和检测限，但是大部分都是利用细胞提取液进行端粒酶检测，无法提供活细胞内端粒酶活性的直接信息。金纳米粒子(AuNP)作为固定DNA的良好底物，可通过金-巯基共价键将DNA连接到表面上，还可以保护DNA在细胞内环境的影响下不被降解。因此AuNP特别适合作为进入细胞的载体运输识别和信号分子。为了简化细胞内端粒酶检测的步骤，提高检测灵敏度，该专利制备的纳米探针为端粒酶响应的荧光“关-开”结构，只有在端粒酶的作用下才会发光，实现细胞酶端粒酶活性的原位成像和检测。通过比较不同细胞内荧光信号的强弱，可区分肿瘤和正常细胞，利用药物作用后细胞内荧光的变化，可实现细胞内端粒酶活性对药物响应的动态检测。三、
技术实现思路
本专利技术的目的是:基于端粒酶的催化作用，设计包含端粒酶引物和荧光分子的分子信标，共价组装在AuNP表面，得到对细胞内端粒酶活性原位成像检测的纳米探针。利用分子信标在端粒酶作用下的延长打开环结构，改变荧光分子与AuNP表面的距离，实现纳米探针荧光的端粒酶响应性恢复。以Hela宫颈癌细胞系为模型，制备的探针实现了细胞内端粒酶活性的原位“关-开”荧光成像和检测，以及端粒酶抑制药物作用后细胞内端粒酶活性变化的动态监测。通过对多种细胞进行成像，证实探针可用于区分肿瘤和正常细胞。本专利技术提出的可对细胞内端粒酶活性进行原位成像的纳米探针如图1所示。以AuNP为载体，在其表面负载带一个缺口、含TSP序列和茎环结构的MB，得到该纳米探针。本专利技术通过以下技术方案来实现:I)具有端粒酶响应性的带一个缺口的MB由两个部分组成:较短的一段是TSP ;较长的一段(1-MB)可形 成环状结构，在茎部3’端有可共价连接AuNP的巯基，在5’端修饰有Cy5，3’端的茎可以与TSP的延长产物互补杂交。2)纳米探针以AuNP为载体，将TSP，1-MB与AuNP混合后，TSP与1-MB杂交形成的MB通过金-巯基共价键组装在金纳米粒子表面，如图1所示。本专利技术的工作原理:本专利技术的工作原理如图2所示，所述的可对细胞内端粒酶活性进行原位成像的纳米探针以AuNP为载体，在其表面上组装含TSP并标记有Cy5的MB。在没有端粒酶存在时，由于MB的环状结构，Cy5靠近AuNP表面，其荧光被AuNP通过荧光共振能量转移而猝灭，纳米探针的荧光状态为“关”。将纳米探针与细胞共温育，探针进入细胞后，在细胞质内端粒酶的作用下，MB内部的TSP被延长，其延长部分与1-MB的3’端茎互补杂交而导致内部链取代，从而打开MB的环，使Cy5远离AuNP表面，荧光信号恢复。通过激光共聚焦荧光显微镜进行观察，可以实现细胞内端粒酶活性的原位成像和检测。利用所述的纳米探针对端粒酶抑制药物作用后的细胞进行端粒酶活性成像，可以分析药物对细胞内端粒酶活性的影响并对其进行动态监测。通过比较不同细胞在探针作用后的共聚焦荧光图像，可以区分肿瘤和正常细胞。与现有技术相比，本专利技术具有以下特点:本专利技术基于AuNP对DNA链的保护功能和易于修饰的特点，制备的MB纳米探针可被端粒酶特异性识别，实现了细胞内端粒酶活性的开关可控原位荧光成像和检测，并且可用于监测药物作用下细胞内端粒酶活性的变化，还可以区分肿瘤和正常细胞。与已有的端粒酶检测方法相比，本专利技术具备以下优点:1.本专利技术所述的纳米探针制备方法简便，细胞毒性低，通过与细胞进行“一步温育”，即可实现细胞内端 粒酶活性的原位荧光成像和检测。该方法无需细胞破碎及其它预处理步骤，与已有方法相比更有优势。2.本专利技术涉及的MB为含端粒酶引物片段TSP、带缺口的茎环结构，TSP可在端粒酶作用下延长并导致MB内部发生链取代反应，使得MB的环被打开而发生构型变化，从而实现具有端粒酶响应特异性的结构转变。3.本专利技术涉及的探针以AuNP为基底，结合荧光共振能量转移导致的荧光猝灭作用和端粒酶响应控制的MB构型改变，实现了由生物分子识别来控制的荧光从猝灭到恢复的转换机制。4.本专利技术所述的纳米探针充分利用AuNP对DNA链的保护作用和金-巯基共价键的稳定性，使探针在细胞外和细胞内都具有很好的稳定性。四、【附图说明】图1.纳米探针的结构及合成示意图图2.纳米探针对细胞内端粒酶原位成像检测的原理图五、【具体实施方式】实施例1:结合图1,合成可对细胞内端粒酶原位成像的纳米探针将10 μ Ll-MB (100 μ Μ)和 10 μ L TSP (100 μ Μ)与 ImLAuNP (13nm, 5ηΜ)混合后，在室温下搅拌过夜。然后将0.1mL含有2MNaCl的磷酸盐缓冲液(PBS，pH7.4)逐滴加入到上述混合液中稳定纳米探针。将上述溶液离心并用PBS洗涤后，重新分散在ImL PBS中，得到MB纳米探针，于4°C条件下保存。实施例2:结合图2，利用纳米探针进行细胞内端粒酶活性的原位成像以HeLa宫颈癌细胞系为基本模型，将HeLa细胞(0.5mL, I X IOW1)种在20_mm共聚焦培养皿中，培养24h。然后将25 μ L探针加入培养皿并温育1.5h,利用激光共聚焦突光显微镜进行观察。在端粒酶阳性的HeLa细胞中，探针表面的MB被打开，荧光恢复，因此在共聚焦显微图像上可以看到细胞质中的荧光信号。将端粒酶抑制药物儿茶素(125yg)与HeLa细胞(0.5mL, I X IOW1)共温育48h，然后加入25 μ L探针并温育1.5h，用共聚焦显微镜观察，可看到细胞内荧光信号的明显降低，说明细胞内端粒酶活性受到药物的抑制。将探针分别与不同种类的肿瘤细胞(HeLa，BGC，MCF，BEL)和正常细胞(QSG)温育后进行荧光观察，肿瘤细胞内的荧 光信号明显强于正常细胞，说明肿瘤细胞内端粒酶活性高表达。本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种可对细胞内端粒酶活性进行原位成像检测的纳米探针，其特征为以金纳米粒子(AuNP)为载体，负载带有一个缺口的DNA分子信标(MB)。该MB为茎‑环结构，并带有一个缺口，将MB分为两段：较短的一段是端粒酶引物序列(TSP)；较长的一段(1‑MB)含环状结构，其茎部3’端的巯基可共价连接AuNP，5’端修饰荧光分子Cy5。

【技术特征摘要】
1.一种可对细胞内端粒酶活性进行原位成像检测的纳米探针，其特征为以金纳米粒子(AuNP)为载体，负载带有一个缺口的DNA分子信标(MB)。该MB为茎-环结构，并带有一个缺口，将MB分为两段:较短的一段是端粒酶引物序列(TSP);较长的一段(1-MB)含环状结构，其茎部3’端的巯基可共价连接AuNP，5’端修饰荧光分子Cy5。2.根据权利要求1所述的纳米探针，其特征在于可特异性响应端粒酶，对细胞内端粒酶活性实现“关-开”可控的原位荧光成像检测。同时还可以区分肿瘤和正常细胞，并动态监测细胞内端粒酶活性在端粒酶抑制药物作用下的变化。3.根据权利要求1和2所述的纳米探针，其特征在于所用MB为茎-环结构，并带有一个缺口，将其分为两段:较短的一段是TSP序列；较长的一段ι-MB含环状结构，其茎部3’端的巯基可共价连接AuNP，5’端修饰有Cy5。...

【专利技术属性】
技术研发人员：鞠熀先，丁霖，钱若灿，
申请(专利权)人：南京大学，
类型：发明
国别省市：江苏;32