本发明专利技术属于生物学和生物技术领域，公开了一种植物原位再生及农杆菌转化的方法。本方法是将农杆菌涂抹在植物砧木伤口上，再将植物离体组织在培养基上诱导产生的愈伤组织作为接穗，劈接法嫁接到砧木上。砧木伤口细胞在外源愈伤组织的诱导下，可以实现原位器官再生，从而得到转基因再生芽。与传统的结合组培的植物遗传转化相比，本发明专利技术避免了逐一基因型摸索组培条件，为植物的遗传转化提供了新的技术平台，同时本发明专利技术也建立了一种新的植物再生体系，为植物发育生物学研究提供了研究系统。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于生物学和生物
，涉及了一种植物细胞原位器官再生结合农杆菌侵染的遗传转化方法。
技术介绍
植物离体器官再生(organ regeneration)是在细胞全能性的理论基础上建立的， 是把植物的器官、组织以至单个细胞，在人工控制的无菌条件下培养，使其生长、分化成完整植株的过程。这种组培技术经过上百年的完善与发展，已实现了上千种植物的培养，在植物无性系的快速繁殖、无病毒种苗培育、新品种的选育、人工种子和种质保存、药用植物和次生物质的工业化生产等方面已广泛应用。在植物基因工程研究领域，植物离体器官再生也是一项重要的实验技术。植物基因工程需要将目的基因转化进入植物细胞，这个过程可以通过农杆菌介导法、基因枪法等操作完成，但无论哪一种方法，都主要依靠转化细胞的再生，即组织培养过程获得转基因植株。结合组培的遗传转化途径有很多优点，如重复性较好，基本不受季节限制，适应性较广， 转化率较高等。但是这种转化途径也有其局限性，主要是转化细胞的再生受基因型的影响较大，同一物种的某些基因型易于组培，而另外一些基因型很难组培成功。况且有些物种， 目前还难于进行组织培养。因此植物再生体系是限制植物遗传转化进一步发展应用的瓶颈。解决这一植物遗传转化发展的瓶颈，可以有两个途径。一个途径是进行大量的正交试验,逐一物种摸索组培条件。但由于组培再生涉及培养基的种类、植物生长调节剂的种类和浓度、温度、光照等多种复杂条件，即使是大豆这样重要的经济作物，经过多年的探索仍是世界公认的组培难，因此这个途径短时间内很难有所突破。另一个途径就是开发全新的植物再生体系，使植物再生不再依赖组织培养。
技术实现思路
为解决上述问题，本专利技术的目的在于提供一种植物原位再生的方法及其在遗传转化中的应用，采用农杆菌原位转化植物，避免了细胞再生的组培过程，应用本方法可以快速建立各种植物的遗传转化体系。本专利技术的目的是通过如下技术方案实现的本专利技术提供的植物原位再生的方法，其特征是A、接穗的获得选取发育饱满无病害的辽园多丽番茄种子，作消毒无菌处理；接种于MS培养基中，于 25°C光照培养箱中日光照16h，培养获得无菌苗；取子叶完全展开、但真叶还未萌发的无菌苗，将子叶、下胚轴切小段作为外植体，置于含有lmg/L玉米素的MS培养基上，于25°C光照培养箱中诱导愈伤组织；获得新鲜愈伤组织作为接穗；B、嫁接取长有5-10片叶子的健壮辽园多丽番茄或盆栽番茄作为砧木，在砧木顶芽下方横切去头，再垂直向下切口。将用作接穗的新鲜愈伤切成楔形，插入砧木切口中嫁接；C、砧木原位再生嫁接后，愈伤组织接穗诱导砧木伤口产生愈伤组织并萌发再生芽。本专利技术提供的植物原位再生的方法在遗传转化中的应用，特征是A、接穗的获得选取发育饱满无病害的辽园多丽番茄种子，作消毒无菌处理；接种于MS培养基中，于 25°C光照培养箱中日光照16h，培养获得无菌苗；取子叶完全展开、但真叶还未萌发的无菌苗，将子叶、下胚轴切小段作为外植体，置于含有lmg/L玉米素的MS培养基上，于25°C光照培养箱中诱导愈伤组织；获得新鲜愈伤组织作为接穗；B、农杆菌的准备将农杆菌在含有50mg/L的利福平和50mg/L的卡那霉素的YEB固体培养基上划线培养，28°C培养72小时；在平板上挑取单克隆，接种到含有50mg/L的利福平和50mg/L的卡那霉素2ml液体YEB培养基，28°C，250rpm培养l_2d直至0D600为O. 6 ;按照1:100的稀释比例将上述少量培养液继续扩繁培养到0D600为O. 5 ;C、农杆菌侵染取长有5-10片叶子的健壮辽园多丽番茄或盆栽番茄作为砧木，在砧木顶芽下方横切去头，再垂直向下切口，在伤口上涂抹农杆菌菌液，进行植物侵染；D、嫁接将接穗的新鲜愈伤切成楔形，插入侵染过的砧木中嫁接，诱导砧木伤口产生愈伤组织并萌发再生芽；E、转化的砧木原位再生嫁接后，愈伤组织接穗诱导侵染过的砧木伤口产生愈伤组织并萌发再生芽。上述农杆菌为EHA105、LBA4404、EHA101、KYRT1、GV3101 或 G58，优选 EHA105 ;包含的质粒为PBI121，PBI121的左右边界内含有卡那霉素抗性基因NPT II。本专利技术提供的一种植物原位再生的方法在遗传转化中的应用，其特征是用于原位再生植物包括番茄、大豆、棉花、桑树、花生、向日葵、番薯、马铃薯、苹果、烟草、薄荷、油菜、黄瓜和拟南芥。本专利技术的积极效果通过非组培的方法，实现了植物的原位再生，并使之与农杆菌介导法相结合实现了植物的遗传转化，避免了传统组培方法的繁琐组培条件，为实现各种植物快速、工厂化的再生与转化提供了一条捷径。附图说明图I为番茄辽园多丽外植体诱导的愈伤组织。图2为愈伤组织接穗嫁接于番茄砧木。图3为辽园多丽砧木伤口生长愈伤组织。图4为辽园多丽砧木伤口的再生芽。4图5为盆栽番爺站'木伤口的再生芽。图6为部分再生芽的PCR检测结果。图7为部分再生芽的southern blot结果。具体实施例方式实施例I :植物原位再生的方法步骤I、接穗的获得选取番爺品种辽园多丽(Solanum lycopersicum L,购自辽宁园艺种苗有限公司)作为试验材料。取发育饱满无病害的辽园多丽番茄种子，用洗衣粉水浸泡lh，冲洗干净；于超净工作台上用75%酒精浸泡30s ;用10%的NaClO溶液消毒20 min,再用无菌水冲洗5次；接种于MS培养基中,MS培养基配方为通用配方(见表I),于25°C光照培养箱中日光照16h,培养7天获得无菌苗。步骤2、嫁接取长有6-10片叶子的健壮辽园多丽番茄或盆栽番茄作为砧木，在砧木顶芽下方横切去头，再垂直向下切口。将用作接穗的新鲜愈伤切成楔形，插入砧木切口中嫁接。令二者紧密贴合，用塑料膜覆盖嫁接部位并紧密包扎。去除所有腋芽，以后萌发的腋芽也要及时去除。嫁接苗置于温室中，日温25°C/夜温18°C，进行正常的苗期管理。避免强光直射。嫁接后，愈伤组织接穗诱导砧木伤口产生愈伤组织并萌发再生芽。再生芽大于I. O cm后，方可逐渐去除包膜。实施例2 :植物原位再生的方法在遗传转化中的应用实例一步骤I、接穗的获得选取番爺品种辽园多丽(Solanum lycopersicum L,购自辽宁园艺种苗有限公司)作为试验材料。取发育饱满无病害的辽园多丽番茄种子，用洗衣粉水浸泡lh，冲洗干净；于超净工作台上用75%酒精浸泡30s ;用10%的NaClO溶液消毒20 min,再用无菌水冲洗5次；接种于MS培养基中,MS培养基配方为通用配方(见表I),于25°C光照培养箱中日光照16h,培养7天获得无菌苗。取子叶完全展开、但真叶还未萌发的无菌苗，将子叶、下胚轴切O. 5cm的小段作为外植体，置于含有lmg/L玉米素的MS培养基上，于25°C光照培养箱中日光照16h诱导愈伤组织。30d左右获得淡绿色、菜花状、结构致密的新鲜愈伤组织作为接穗(图I)。权利要求1.一种植物原位再生的方法，其特征是A、接穗的获得选取发育饱满无病害的辽园多丽番茄种子，作消毒无菌处理；接种于MS培养基中，于 25°C光照培养箱中日光照16h，培养获得无菌苗；取子叶完全展开、但真叶还未萌发的无菌苗，将子叶、下胚轴切小段作为外植体，置于含有lmg/L玉米素的MS培养基上，于25°C光照培养本文档来自技高网...
【技术保护点】
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：曹慧颖，夏润玺，张立军，吕淑霞，崔振海，张宁，张少斌，
申请(专利权)人：沈阳农业大学，
类型：发明
国别省市：
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