本发明专利技术提供了一种Leber遗传性视神经病变体外诊断试剂盒，包括SEQIDNO.1～12。本发明专利技术为LHON临床诊断提供快速、准确、廉价的基因水平检测手段，可实现LHON的预防和早期及时诊断，能够发现高危人群，提高LHON的诊断率，进行有效的产前遗传咨询和婚前咨讯，提高人口素质，降低家庭和国家的医疗开支。
【技术实现步骤摘要】
一种Leber遗传性视神经病变体外诊断试剂盒
本专利技术涉及诊断试剂盒，用于Leber遗传性视神经病变的体外诊断。
技术介绍
Leber 遗传性视神经病变(Leber hereditary optic neuropathy, LHON)是一种以母系遗传为特征的线粒体遗传病，是迄今临床上最常见的遗传性视神经疾病之一。LHON临床主要表现为双眼急性或亚急性中心视力下降，也是目前青少年致盲的主要原因之一，严重威胁青少年健康。尽管目前许多临床检查手段如眼底荧光血管造影(FFA)、视网膜电图(ERG)等，有助于LHON的辅助诊断；但对于遗传性的LHON病变早期，大部分患者无家族史或家族史不清，临床表现轻微如仅有视神经损害，使得其早期临床诊断及治疗十分困难，这可能导致病情持续发展从而致盲，因此LHON的早期诊断尤为必要。目前研究已经明确线粒体DNA(mtDNA)基因突变是LHON致病的主要分子机制，使得基因水平诊断成为LHON临床确诊的最直接手段。尽管目前已有部分基因分析方法在试图对LHON mtDNA突变进行了筛查分析，但由于费用昂贵、手续复杂、耗时长、漏诊率高等因素，限制了其在临床推广使用。 因此有必要开展一些新的基因诊断技术，并将其用于搭建LHON基因诊断检测平台，为LHON临床早期临床诊治提供重要依据；更重要的是对发现高危人群，进行有效的产前遗传咨询及诊断、婚前筛查，在提高人口素质方面具有极其重要的社会意义；而且可减少家庭和国家的医疗负担，具有重大的经济应用前景。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种Leber遗传性视神经病变体外诊断试剂盒，能够一次鉴定正常与突变的DNA，以及其突变是纯合子或杂合子。本专利技术的目的是通过以下措施实现的:一种Leber遗传性视神经病变体外诊断试剂盒，包括SEQ ID N0.1~12。SEQ IDN0.1~4，SEQ ID N0.5~8，SEQ ID N0.9~12分别针对Leber遗传性视神经病变(LHON)致病相关的三个原发突变位点G3460A (NDl)、G11778A(ND4)与T14484C (ND6)，针对每一个突变位点分别采用四条引物-两条外引物和两条内引物，两条外引物扩增的片段作为PCR体系的内对照，排除体系自身原因造成的误诊，两条内引物分别反向扩增突变及正常的等位基因，能够一次鉴定正常与突变的DNA，以及其突变是纯合子或杂合子。本专利技术试剂盒的诊断原理如图1所示，Pl和P2为扩增含有突变点基因片段的外引物，SI和S2为两条特异性引物即内引物，分别与DNA双链的两条单链互补，其3’端正好与SNP位点重合，由引物的3’端控制着引物的延伸反应，根据延伸产物的长度确定SNP类型，并通过在引物的3’端区域引入一个人为不匹配碱基来提高延伸反应的特异性。野生型(W)基因只能与相匹配的特异性引物S2发生延伸反应。特异性引物SI由于其3’末端碱基与模板不配对，故不发生延伸反应，因此PCR扩增后的产物只有DNA片段P1P2和P1S2 ；同理，突变型(M)基因仅与其配对的特异性引物SI发生延伸反应，特异性引物S2由于其3’末端碱基与模板不配对，故不发生延伸反应.因此PCR扩增后的产物只有DNA片段P1P2和S1P2。上述Leber遗传性视神经病变体外诊断试剂盒，SEQ ID N0.1:SEQ ID N0.2 =SEQID N0.3:SEQ ID N0.4 = 10:10:1:1, SEQ ID N0.5:SEQ ID N0.6:SEQ ID N0.7:SEQ IDN0.8 = 20:20:1:1, SEQ ID N0.9:SEQ ID N0.10:SEQ ID N0.11:SEQ ID N0.12 = 5:5:1:1，以摩尔比计。本试剂盒特定调整外引物与内引物用量，其效果在于有效的平衡外侧与内侧PCR产物扩增效率，提高结果的特异性，便于扩增结果的准确判读。为了更简单方便的得到更清晰易辨的检测结果，上述Leber遗传性视神经病变体外诊断试剂盒的使用方法是将引物SEQ ID N0.1~4、SEQ ID N0.5~8或SEQ ID N0.9~12分别与DNA扩增模板、 DNA聚合酶、dNTP混合后在95°C保温lOmin，然后按95°C 30s,65°C或55°C 30s,72°C 30s的条件进行35个循环，在72°C保温IOmin进行成像或测序检测。有益效果1.使用本专利技术的试剂盒，可直接通过PCR扩增条带的长度，一次性鉴定Leber遗传性视神经病变正常与突变的DNA以及其突变是纯合子或杂合子。2.本专利技术排除了多引物使用时对检测结果的交叉影响，特异性强，无假阳性、无杂带产生，准确率高，阳性检出率可达到95%以上。3.本专利技术可进行三个单管PCR同时扩增，一次电泳得到检测结果，所需仪器简单，具有操作简单、观察简单、耗费低廉、检测快速而准确的优势，适合临床推广普及，产业化应用。4.本专利技术为LHON临床诊断提供快速、准确、廉价的基因水平检测手段，可实现LHON的预防和早期及时诊断，能够发现高危人群，提高LHON的诊断率，进行有效的产前遗传咨询和婚前咨讯，提高人口素质，降低家庭和国家的医疗开支。【附图说明】图1本专利技术试剂盒的诊断Leber遗传性视神经病变的原理；图2实施例1①PCR扩增产物成像结果；图3实施例1②PCR扩增产物成像结果；图4实施例1③PCR扩增产物成像结果；图5为实施例1①m.11778G>A位点无突变的测序图局部；图6为实施例1①m.11778G>A位点为纯合突变的测序图局部，方框内显示为G突变为A;图7为实施例1①m.11778G>A位点为杂合突变的测序图局部，方框内显示为G突变为A;图8为实施例1②14484T>C位点无突变的测序图局部图9为实施例1②m.14484T>C位点为纯合突变的测序图局部，方框内显示为T突变为C图10为实施例1②m.14484T>C位点为杂合突变的测序图局部，方框内显示为T突变为C图11为为实施例1③m.3460G>A位点无突变的测序图局部图12为实施例1③m.3460G>A位点为纯合突变的测序图局部，方框内显示为G突变为A;图13为为实施例1③m.3460G>A位点为杂合突变的测序图局部，方框内显示为G突变为A ；【具体实施方式】下面结合实施例对本专利技术的【具体实施方式】做进一步的描述，并不因此将本专利技术限制在所述的实施例范围之中。实施例11.样本:人全血提取的DNA(50~100ng/ul)。样本I和2为正常对照，是指扩增模板来源于来源于无下述三个突变的正常人血DNA ;样本3和4为纯合突变体，是指扩增模板来源于三个位点的阳性参考品质粒DNA，阳性参考品质粒为m.11778G>A ；m.14484T>C ；m.3460G>A三位点的人工突变片段质粒；样本5和6为杂合突变，是指扩增模板来源于阳性参考品质粒与无突变的正常人血DNA混合模版。2.试剂:GoTaq* Hot Start Green Master Mix, 2 X:包含 2 X Green Go TaqReaction Buffer (ρΗ8.5)、400 μ M dATP,400yM GATP、400本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种Leber遗传性视神经病变体外诊断试剂盒，包括SEQ ID NO.1～12。
【技术特征摘要】
1.一种Leber遗传性视神经病变体外诊断试剂盒，包括SEQ ID N0.1~12。2.如权利要求1所述的Leber遗传性视神经病变体外诊断试剂盒，SEQID N0.1:SEQ ID N0.2:SEQ ID N0.3:SEQ ID N0.4=10:10:1: 1，SEQ ID N0.5:SEQ ID N0.6:SEQID N0.7:SEQ ID N0.8=20:20:1:1, SEQ ID N0.9:SEQ ID N0.10:SEQ ID N0.11:S...
【专利技术属性】
技术研发人员：黄轶，李阳，宋利华，
申请(专利权)人：重庆医科大学附属儿童医院，黄轶，
类型：发明
国别省市：重庆;85
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