双束激光质谱法原位检测动物组织中药物分子的方法技术

本发明专利技术公开了一种应用双束激光质谱法原位检测动物组织中药物分子的方法。该方法是将药物分子溶液加到离体的动物肿瘤组织上，充分扩散后，冷冻，切片。切片固定在超声处理的石墨上，石墨放入双束激光质谱仪，双束激光质谱仪发射的解析激光聚焦后进入电离室中并且照射在切片上，经过18～30μs延迟，再发射第二束脉冲激光，第二束脉冲激光经过气体池三倍频后转化为真空紫外激光，在气体池出光口用平凸镜聚焦分离第二束脉冲激光和真空紫外激光；真空紫外激光聚焦后以平行于石墨棒的方向进入电离室中并且与解析激光实现交叉，再对离体肿瘤组织切片进行气化-解析和电离，电离的离子经过飞行管飞行，数据采集处理。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于一种小分子药物开发的检测
，特别涉及一种应用双束激光质谱法(L2MS)检测动物组织中药物分子的方法。
技术介绍
双束激光质谱法(Two-stepLaser Desorption/Laser IonizationMassSpectrometry, L2MS)是采用两束激光分别完成气化/解析和电离的任务,L2MS有如下优点其一，因解析激光和电离激光在时间和空间上是分开的，因此可以根据实际的需要很方便的单独优化两束激光的能量和波长；其次，该实验技术所需要的样品量极少，也不需要在待测样品中人为地添加其它的化学物质作为基质，样品准备简单，避免了样品的二次污染。双束激光质谱技术以其独特的优点在分析化学与生命科学领域日益受到重视。双束激光质谱法在最近的一二十年间获得了很大的发展。其应用首先是在生物领域，包括短肽，氨基酸等生物小分子，药物分子，化学添加剂等化学分子的检测，LukeHanley, Richard N. Zare等研究团队都有专门的小组进行此方面的研究,近年来都有文章 发表，在此基础上发展起来的表面分析技术可发展成为一种新的生物芯片分析技术。另外，该技术与显微成像技术相结合，有望研发出一种新的质谱成像技术，并应用于生命科学领域。最近Hanley教授发表了一篇关于生物质谱成像方面的综述性文章，介绍了双束激光质谱方法在该方面的一些最新进展，说明在生物质谱检测方面，该技术方法将具有很好的发展前景。亚甲基蓝(Methylene Blue，MB)为一种噻嗪染料类化合物，为水溶性色素。高浓度时直接使血红蛋白氧化为高铁血红蛋白，低浓度时，在还原型辅酶I脱氢酶的作用下，能将高铁还原型蛋白还原为血红蛋白。早在20世纪30年代就发现亚甲蓝可与病毒的核酸及脂质包膜结合，在可见光的作用下，使病毒包膜破损，核酸断裂，进而导致大多数的脂质包膜病毒和部分非脂质包膜病毒失活。随后，亚甲基蓝的光动力治疗一直被人们所利用。但是，目前对亚甲基蓝的检测主要还是比较的少，主要是拉曼光谱以及色谱的方法，但都无法在生物组织内部对亚甲基蓝进行检测。因此，发展一种利用双束激光质谱法简单快速检测生物组织内药物小分子的方法显得尤为重要。
技术实现思路
为了解决上述现有技术的不足，本专利技术的目的在于提供一种，该方法快速原位、无需前期处理，方便、灵敏度极高。本专利技术的目的通过下述技术方案实现一种应用，包括以下操作步骤(I)将药物分子溶液加到离体肿瘤组织上，使药物分子溶液在离体肿瘤组织中充分扩散；(2)将经过步骤(I)处理的离体肿瘤组织进行冷冻，用包埋剂将离体肿瘤组织包埋后，用冷冻切片机进行切片，得到离体肿瘤组织切片；(3)对承载基底石墨棒进行清洗处理，将步骤(2)处理所得离体肿瘤组织切片放在已处理的石墨棒上，把石墨棒固定在双束激光质谱仪的进样杆上，经进样系统进入双束激光质谱仪的真空设备中进行检测；(4)开启双束激光质谱仪，双束激光质谱仪中的两台固体激光器分别依次发射脉冲激光，发射的第一束脉冲激光为解析激光，解析激光聚焦后进入电离室中并且照射在石墨棒上的离体肿瘤组织切片上，经过18 30 μ s延迟，再发射第二束脉冲激光，第二束脉冲激光经过气体池三倍频后转化为真空紫外激光，在气体池出光口用平凸镜聚焦分离第二束脉冲激光和真空紫外激光；真空紫外激光聚焦后以平行于石墨棒的方向进入电离室中并且与第一束脉冲激光实现交叉，再对第一束脉冲激光气化-解析后产生的气羽进行电离，电离的离子经过飞行管飞行，被微通道板检测，再通过数据采集装置显示及采集，最后在电脑上进行数据处理。所述步骤(I)是在无菌条件下进行操作的；步骤(I)所述离体肿瘤组织为被Hela细胞感染的老鼠的皮下离体肿瘤组织；所述离体肿瘤组织的大小为15mmX5mmX4mm ;所述药物分子溶液的浓度为lX10_4mol/L，其用量为10 100 μ I ;所述充分扩散的时间是10 20mino步骤(I)所述药物分子溶液是亚甲基蓝溶液。步骤(2)所述进行冷冻是先将经过步骤(I)处理的离体肿瘤组织投入用干冰冷却的异戊烷中15 20s，再放入-80°C的冰箱里冷冻保存；所述包埋剂是OCT冰冻切片包埋剂；所述冷冻切片机是在-19 -24°C的环境下工作，冷冻切片机工作前提前开机I. 5 2. O小时；所述切片的厚度为200 400 μ m。步骤(3)所述石墨的纯度为99. 999% ;所述清洗处理是将石墨分别在乙醇和超纯水中进行超声清洗，清洗是在20 50KHz下处理20 40min。步骤(4)所述第一束脉冲激光的波长为1064nm ;所述第二束脉冲激光出固体激光器时的波长为355nm，经过气体池三倍频后转化为真空紫外激光时的波长为118nm ；所述飞行管长度为1.5m;所述气体池为30cm高，底部直径7cm的圆柱型金属管；所述气体池中的配气为体积比1:10的氙气和氩气混合气体；所述气体池中的气压为200torr ；所述平凸镜为MgF2平凸透镜，其凸面对着气体池，斜度为8°，直径25. 4mm，焦距75mm ；所述飞行管和真空设备中的真空度为IX 10_6 IX 10_5pa ；所述数据采集装置是采用安捷伦的示波器，采集的平均次数为512次；所述电脑是利用Origin软件进行数据处理。步骤(4)所述实现交叉是实现垂直交叉。步骤(4)所述固体激光器发射脉冲激光的触发、延迟时间的设置和数据采集均是由数字延时发生器来控制的。所述数字延时发生器为Stanford ResearchSystems生产的，其型号为DG535。一种实现上述方法的双束激光质谱仪，该双束激光质谱仪包括数字延时发生器、进样系统、固体激光器、真空系统、气体池、平凸镜、数据采集装置和数据处理装置；所述真空系统包括电离室、飞行管和微通道板，飞行管的一端连接着电离室，另一端设置微通道板微通道板；所述固体激光器为两台，分别置于真空系统旁边，其中一台固体激光器与电离室之间设置气体池，在气体池靠近电离室的一侧设置平凸镜；所述数字延时发生器、固体激光器、微通道板、数据采集装置和数据处理装置依次电气连接。本专利技术的原理在于在石墨棒上贴好处理过的切片，把石墨棒固定在进样杆上，经进样系统进入真空电离室，样品被第一束激光解析后，再经过适当时间的延迟，第二束激光经气体池三倍频后转化为真空紫外激光对解析后的气羽进行电离，获得的质谱图背景简单，样品中组织的质谱信号主要来自于组织中的氨基酸或者短肽的碎片，质量数主要在IOODa以下。而预先加有药物分子肿瘤组织的质谱图中，药物分子的质谱主峰一般出现在质谱图中质量数较高的区域，与样品组织信号没有重叠，这样就能很好的检测组织中药物分子的存在。与现有技术相比，本专利技术具有如下的优点及有益效果 (I)本专利技术的双束激光质谱分析方法，利用质谱原理可以提取混合体系中各个要素的浓度信息，通过改变两束激光空间和时间的交叉得到更好的图谱信号。(2)本专利技术操作简单，预处理时间短，可以在短时间内进行多次检测，这对于提高其应用性具有广泛的意义。(3)本专利技术为双束激光质谱成像的进行奠定了基础。附图说明图I是本专利技术所述应用双束激光质谱法原位检测动物组织中亚甲基蓝的流程示意图。图2是双束激光质谱法的实验原理图。其中I为进样系统，2为固体激光器，3为飞行管，4为微通道本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种应用双束激光质谱法原位检测动物组织中药物分子的方法，其特征在于包括以下操作步骤：（1）将药物分子溶液加到离体肿瘤组织上，使药物分子溶液在离体肿瘤组织中充分扩散；（2）将经过步骤（1）处理的离体肿瘤组织进行冷冻，用包埋剂将离体肿瘤组织包埋后，用冷冻切片机进行切片，得到离体肿瘤组织切片；（3）对承载基底石墨棒进行清洗处理，将步骤（2）处理所得离体肿瘤组织切片放在已处理的石墨棒上，把石墨棒固定在双束激光质谱仪的进样杆上，经进样系统进入双束激光质谱仪的电离室中进行检测；（4）开启双束激光质谱仪，双束激光质谱仪中的两台固体激光器分别依次发射脉冲激光，发射的第一束脉冲激光为解析激光，解析激光聚焦后进入电离室中并且照射在石墨棒上的离体肿瘤组织切片上，经过18～30μs延迟，再发射第二束脉冲激光，第二束脉冲激光经过气体池三倍频后转化为真空紫外激光，在气体池出光口用平凸镜聚焦分离第二束脉冲激光和真空紫外激光；真空紫外激光聚焦后以平行于石墨棒的方向进入电离室中并且与第一束脉冲激光实现交叉，再对第一束脉冲激光气化？解析后产生的气羽进行电离，电离的离子经过飞行管飞行，被微通道板检测，再通过数据采集装置显示及采集，最后在电脑上进行数据处理。...

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：胡勇军，王红磊，杨晴，官凯文，李卫星，
申请(专利权)人：华南师范大学，
类型：发明
国别省市：