复制细胞的快速检测制造技术

本发明专利技术提供了一种通过利用大范围成像检测原位细胞分裂形成的微观集落，从而有效、快速且灵敏地计数活细胞的方法。基于本发明专利技术的微生物计数实验解决了临床和工业微生物学中的一个重要难题－采用传统方法检测所需的长时间－同时保留了以微生物培养为基础的传统方法的关键优势。本发明专利技术的实施方案包括不利用标记试剂检测细胞微集落的非破坏性无菌方法。这些方法可以产生用于微生物鉴定和确定抗微生物抗性的纯培养物。（*该技术在2022年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】

技术介绍
本专利技术涉及对医学、工业和环境样本中存在的复制细胞，尤其是微生物细胞(如细菌、酵母和霉菌)的检测、计数与鉴定。微生物培养由于具有很多引人注目的特点，因此是这些市场(markets)的主导方法。本专利技术解决了微生物培养的主要缺陷-获得结果所需要的时间长-同时保留了该方法的优势。用于检测和计数微生物的微生物培养19世纪到20世纪间，出现了一种关于细菌、酵母和霉菌在引起传染性疾病，以及确定食品和饮料品质方面所扮演角色的认识。初期，发展出微生物培养这种有效的方法，以检测少量微生物。微生物培养通过利用微生物迅速且大量增殖的倾向，从而实现了对微生物简单地目视检测。例如，当把过小而令肉眼难以发现的单个细菌细胞(约百万分之一米)接种入营养肉汤中时，便可在不超过24小时的时间内令肉汤变得明显浑浊。被称为微生物计数或集落计数的相关微生物培养技术量化了样本中的微生物细胞数量。基于原位微生物复制的微生物计数方法通常获得的是对应于样本中每个微生物细胞的一个可目测“集落”。因此，计数可见集落便可使微生物学家准确测定样本中的微生物细胞数量。为进行微生物计数，需要将细菌细胞分散在培养皿中的营养琼脂表面(“琼脂平板”)，并于适合原位细菌复制的条件下进行培养。无法目测的个体微生物重复地复制，在祖代微生物细胞所附着的物理位点产生大量相同的子代微生物。子细胞仍然与原始细胞共同定位(基本相邻)，从而群体子细胞(可能生长为数千万、数亿的细胞)最终得以在平板上形成可见集落。计数微生物集落的电子方法已有所发展。但是与通过肉眼进行的传统计数方法相比，大多数这种自动集落计数基本上未提高灵敏度或缩短获得结果所需的时间。集落计数器利用了多种光学方法检测集落，包括检测微集落固有光学特性(如U.S.Patent No3,493,772；U.S.Patent No3,811,036；U.S.Patent No5,290,701；Arkin，A.P.，等(1990)；Biotechnology(NY)8746-9)以及环绕集落的基质中pH指示剂分子的颜色变化(U.S.Patent No.5,510,246)。利用染色剂或探针标记集落的方法也有所发展，将于下文论述。即使是在一个多世纪之后，事实也证明微生物培养是一种非常成功的方法，该方法仍然主导了医学微生物学和工业微生物学中的质量控制检验(如药品、食品和饮料生产)。该方法经济、相对简单并且超灵敏。微生物培养的灵敏度可见于针对绞细牛肉(ground beef)中食物来源病原体的常规检验中。采用微生物培养可以在25克绞细牛肉中检测到单个微观细菌性病原体细胞。微生物培养的另一个优势在于其能够检测大范围的具有医学和工业意义的微生物。原位细菌复制的一个优势是可以生成纯粹或纯系细胞群体(被称为纯培养物、克隆或集落)。纯培养物是相同祖细胞来源的相同活细胞的大量集合。对鉴定微生物和确定抗生素抗性的方法而言，纯培养物是必需的。由于细菌性病原体通常是伴随非致病性细菌从非无菌的临床样本(如粪便或创伤)中分离而得，其中该非致病性细菌可能比该病原细胞还要多，因此医学微生物学严重依赖着纯培养。纯微生物培养物的分离在工业微生物学中也是重要的。例如，药物和化妆品生产商必须检验其产品是否存在微生物污染物。污染微生物的纯培养物被用于微生物鉴定，可以确定一个生产批次是否必须被抛弃，并有助于调查工业过程中的污染源。 表1选择性培养微生物的能力是鉴定微生物和确定对抗菌剂，如抗生素的抗性及敏感度的一种基本工具。选择性培养利用了不同微生物需要不同生长条件的事实。这些差异起因于微生物菌株在其生化组成方面存在差异的事实，其中生化组成方面的差异是其固有遗传差异导致的。例如，一种类型的微生物可能在含有可支持其生长的单一碳源，糖类山梨糖醇的营养培养基上生长，而另一种类型的微生物则不能。选择性生长在食品工业中是重要的。例如，通过将样本接种至只适合沙门氏菌生长，而不适合其它食品微生物的培养基中，便可以观测到食品样本中是否含有特定食品病原体-沙门氏菌。同样，选择性培养被用于确定哪一种抗生素在杀伤分离自细菌性脑膜炎患儿脊髓液的细菌菌株方面最为有效。以纯细菌培养物(来源自营养琼脂平板的纯系集落)接种含不同浓度多种抗生素的生长培养基。最佳抗生素疗法是通过监测微生物在不同抗生素存在条件下生长的能力而确定的。通过在固体营养琼脂培养基表面的选择性生长，从而确定抗生素抗性和灵敏度的方法是另一种常用方法。例如，在Kirby-Bauer法中，将含有不同抗生素的小滤纸圆片置于营养琼脂平板表面上，该平板已包被有临床样本来源的细菌纯培养物。从该滤纸片向外放射状扩散出一个抗生素梯度。对高水平抗生素具有抗性的细菌生长在滤纸片边缘。而对该抗生素非常敏感的细菌则如果不远离滤纸片边缘便不能生长。平板培养(通常持续一或两天)结束后，微生物学家通过测定滤纸片周围的无生长圈或区域的宽度，便可确定该细菌对抗生素的抗性水平。相关方法，“E”试验(Hardy Diagnostics)利用了含有梯度抗生素的方形条带。通过测定可使条带附近细菌持续复制的条带上最高抗生素浓度的点，便可确定细菌的抗性水平。微生物培养的最大缺点是慢-需耗时以产生目测所需的细胞数量。微生物培养所需的长生长期在保健和工业两方面都是一个重要难题。例如，因为需要若干天培养并鉴定引起患者血液感染的微生物，因此在抗真菌疗法开始之前，真菌血液感染患者可能已死亡。某些感染物，如引起结核病的细菌，通常需要在培养中生长数周。检测结核分枝杆菌所需的长时间可能致使结核病患者传染许多人患上这一高度接触性传染病，或者令未患结核病的患者遭受到无谓的检疫隔离。在食品生产中，长的检验周期会加剧食品腐败，或者导致检验物料在后继加工步骤中不恰当的转移。缓慢的微生物培养也会对生物药品和疫苗的生产产生不利影响。在这些应用中，生产过程通常需要将几个批次集中。由于长的微生物培养检验环节，以及贯穿生产过程的物料转移需要，有时直到批次集中环节才检出被污染批次。如果随后发现被污染批次与未被污染批次混合在一起，则整个库的混合批次都必须被抛弃。微生物培养的其它缺点，如繁重的人工操作，以及不能培养某些微生物，则被认为不如需要的长时间所带来的难题严重。例如，即使已经引入了自动接种和分析设备，人工操作方法仍然主导了微生物计数。环境中发现的大部分类型微生物不能在实验室内生长。不过，这种微生物通常对人类无害，或者在工业生产过程中已被破坏，因此在大多数应用中被忽视了。然而，具有重要医学价值的若干重要例外包括难以或不可能培养可引起性病或肺炎的细菌菌株，诸如衣原体。幸运的是，有可选的不依赖培养的方法可以应用在这些情况中(见下文)。快速微生物培养计数方法用于更为快速计数微生物的若干微生物培养方法已有所发展。一种快速微生物培养方法是使细菌细胞沉积在包被有营养培养基的显微镜载玻片上。由于显微镜可以检测到由少量细胞分裂而形成的微集落，所以采用显微镜检验会比肉眼更早检测到微生物的生长。不过，在检验含少量微生物细胞的大样本方面，该方法并不有效，因为在显微镜视野中仅能观测非常小体积的样本。显微镜方法的低灵敏度通常限制了其检测每毫升含有超过一万个细菌细胞的样本的效果-这些方法的灵敏性远低于传统微生物培养。电子成像系统本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种检测样本中活的靶细胞的方法，该方法包括如下步骤：（ａ）将该样本中存在的活的靶细胞以每平方毫米检测面积不超过１００个靶细胞的密度提供在包括检测面积在内的检测区中，其中在该检测区内，所述细胞是随机分散且固定的；（ｂ）所述靶细 胞通过原位复制形成一个或多个微集落；和（ｃ）检测所述一个或多个微集落；其中所述检测面积的最长线性维度大于１ｍｍ；所述一个或多个微集落在至少两个正交维度上具有不超过５０微米的平均量度；所述一个或多个微集落中的细胞在检测之后保留 了复制能力。

【技术特征摘要】
...

【专利技术属性】
技术研发人员：D斯特劳斯，
申请(专利权)人：基因描绘系统有限公司，
类型：发明
国别省市：US[美国]