截短的人乳头瘤病毒45型L1蛋白制造技术

本发明专利技术涉及一种截短的人乳头瘤病毒45型L1蛋白，其编码序列和制备方法，以及包含其的病毒样颗粒，所述蛋白和病毒样颗粒可用于预防HPV（特别是HPV45）感染及由HPV（特别是HPV45）感染所导致的疾病例如宫颈癌等。本发明专利技术还涉及上述蛋白和病毒样颗粒用于制备药物组合物或疫苗的用途，所述药物组合物或疫苗用于预防HPV（特别是HPV45）感染及由HPV（特别是HPV45）感染所导致的疾病例如宫颈癌等。

【技术实现步骤摘要】
截短的人乳头瘤病毒45型L1蛋白
本专利技术涉及分子病毒学和免疫学领域。具体地，本专利技术涉及一种截短的人乳头瘤病毒45型L1蛋白，其编码序列和制备方法，以及包含其的病毒样颗粒，所述蛋白和病毒样颗粒可用于预防HPV（特别是HPV45）感染及由HPV（特别是HPV45）感染所导致的疾病例如宫颈癌等。本专利技术还涉及上述蛋白和病毒样颗粒用于制备药物组合物或疫苗的用途，所述药物组合物或疫苗用于预防HPV（特别是HPV45）感染及由HPV（特别是HPV45）感染所导致的疾病例如宫颈癌等。
技术介绍
人乳头瘤病毒(HumanPapillomavirus，HPV)属于乳头瘤病毒科(Papillomaviridae)乳头瘤病毒属，为无包膜DNA病毒。该病毒基因组为双链闭环DNA，大小约为7.2～8kb，具有8个开放阅读框。该病毒基因组按功能的不同可以分为三个区域：①早期区(E)，约4.5kb，编码E1、E2、E4～E7共6个与病毒复制，转录及转化有关的非结构蛋白；②晚期区(L)，约2.5kb，编码主要衣壳蛋白L1和次要衣壳蛋白L2；③长调控区(LCR)，位于L区末端与E区起始端之间，长约800～900bp，不编码任何蛋白，含DNA复制和表达调控元件。HPV病毒颗粒直径为45～55nm，核衣壳呈20面体对称，有72个壳微粒，由L1及L2组成。目前已知的HPV约有90多种亚型，在人群中主要引起皮肤，粘膜的疣状病变。根据其与肿瘤发生的关系，HPV可分为3组：①低或无致癌风险组，包括HPV6、11、39、41、42、43；②中度致癌风险组，包括HPV31、33、35、51、52；③高度致癌风险组，包括HPV16、18、58、45。HPV分子流行病学调查证实，高危型HPV感染是宫颈癌发生的重要启动因子。在所有宫颈癌标本中，HPVDNA检出率高达80％以上。宫颈癌是一种常见的女性恶性肿瘤，其发病率仅次于乳腺癌，是严重威胁女性健康的杀手。据统计，每年世界范围内约有490,000例的新发病例，约有270,000人死于该疾病（Boyle，P.，andJ.Ferlay.AnnOncol2005，16:481-8）。在所有宫颈癌病例中，发生于发展中国家的占了约83％，在这些国家中，宫颈癌甚至能够占到女性恶性肿瘤的15％。而在发达国家，这个数字仅占到1.5％。在撒哈拉以南地区，中南亚，拉丁美洲，东亚均为宫颈癌的高发区。我国也属于宫颈癌高发区。在陕西略阳县，已婚妇女中宫颈癌的发病率高达1026/100000。有关世界范围内宫颈癌标本中HPV型别分布的荟萃分析发现，宫颈癌中最常见的HPV型别依次是16、18、58、33、45、31、52、35、59、39、51、59、68、6、73、66、70、82（按照降序排列）。在宫颈癌患者中HPV45的感染率为4.4%，在HPV16(54.4%)、HPV18(16.5%)、HPV58(5.1%)、HPV33(4.7%)之后，位于第5位(YPBao，NLi，JSSmithandYLQiao.InternationalJournalofSTD&AIDS，2008，19:106-111)。这说明HPV45在世界范围内的妇女宫颈癌患者中的感染率较高，是普遍易感染的HPV型别之一。目前已上市的HPV疫苗为Merck的及GSK的上述两种疫苗分别含有HPV6/11/16/18及HPV16/18VLP，但均不包含在中国及亚洲妇女中普遍易感的HPV45型别VLP。因此，针对中国以及亚洲等发展中国家妇女安全有效的HPV疫苗，特别是针对HPV16，18及45等高危型别的疫苗，是有效预防宫颈癌，改善广大妇女（特别是我国及亚洲妇女）健康状况的有效途径。HPVL1蛋白为主要衣壳蛋白，分子量为55-60kDa，是HPV疫苗主要靶蛋白。在多种表达系统中表达的HPVL1蛋白无需L2蛋白辅助即可形成在形态结构上与天然病毒颗粒相似的病毒样颗粒（Virus-LikeParticle，VLP）。该病毒样颗粒为二十面体立体对称结构，由72个L1蛋白的五聚体组成。其保留了病毒颗粒的天然表位，具有较强的免疫原性，可诱导针对同型HPV病毒的中和抗体(Kirnbauer，R.，F.Booy，etal.1992ProcNatlAcadSciUSA89(24):12180-4)。并且，病毒样颗粒不带有病毒核酸，无潜在致癌危险，具有良好的安全性。因此，VLP疫苗已成为HPV疫苗发展的主要方向。HPVVLP疫苗研制的关键是能够大量高效制备VLP样品。目前较为常用的VLP表达系统可以分为真核表达系统及原核表达系统。常用的真核表达系统有痘病毒表达系统、昆虫杆状病毒表达系统、酵母表达系统。在真核表达系统中所表达的HPVL1蛋白天然构象破坏少，能自发形成VLP，往往只需进行简单的密度梯度离心即可得到纯化的VLP，为纯化工作提供极大的便利。但是由于真核表达系统的表达量低，培养成本高，给大规模工业化生产带来了极大困难。目前已上市的HPV疫苗采用了酿酒酵母表达系统，其表达量低，生产成本高，因此该产品价位偏高，影响其广泛应用。在原核表达系统中利用大肠杆菌表达系统表达HPVL1蛋白已有报道。例如已报道利用大肠杆菌表达HPV16L1蛋白（Banks，L.，G.Matlashewski，etal.(1987).JGenVirol68(Pt12):3081-9）。但是大肠杆菌表达的HPVL1蛋白大多失去其天然构象，不能产生针对HPV的保护抗体。或者尽管上述蛋白通过包含体纯化，复性等步骤也可得到HPVVLP（Kelsall，S.R.andJ.K.Kulski(1995).JVirolMethods53(1):75-90），但是在复性过程中蛋白损失量大，得率低，因此，难以在大规模生产上应用。虽然HPVL1蛋白也可以在大肠杆菌中以正确构象可溶性地表达，溶解于菌体的裂解上清中，但是其表达量较低，而且上清中杂蛋白种类多且量大，要从中纯化出目的蛋白难度相当大。虽然也有文献报道通过GST融合表达的方式可以增加上清中L1蛋白的表达量，而且有助目的蛋白的纯化（Li，M.，T.P.Cripe，etal.(1997).JVirol71(4):2988-95），但融合蛋白的切割往往需要价格昂贵的酶，依然无法应用于大规模生产。因此，本领域仍然需要能够低成本获得且能够诱导针对HPV的保护性抗体的HPVL1蛋白及由其组成的病毒样颗粒，从而使大规模工业化生产宫颈癌疫苗成为可能。
技术实现思路
本专利技术至少部分基于专利技术人的出人意料的发现：利用大肠杆菌表达系统能大量表达可以诱导针对HPV45的中和抗体的截短的HPV45L1蛋白，该截短的HPV45L1蛋白具有高产率，且经纯化后纯度可达到96％或更高，并且纯化后的所述蛋白经进一步处理可得到可诱导针对HPV45的保护性抗体的病毒样颗粒。因此，在一个方面，本专利技术涉及一种截短的HPV45L1蛋白或其变体，其与野生型HPV45L1蛋白相比，N端截短了27-40个氨基酸，例如27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39和40个氨基酸。在一个优选的实施方案中，与野生型HPV45L1蛋白相比，该截短的HPV45L1蛋白的N端截短了27个、30个、35个本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种截短的HPV45L1蛋白或其变体，其与野生型HPV45L1蛋白相比，N端截短了27‑40个氨基酸，例如27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39和40个氨基酸；优选地，与野生型HPV45L1蛋白相比，该截短的HPV45L1蛋白N端截短了27个、30个、35个或40个氨基酸；优选地，该截短的HPV45L1蛋白具有SEQ ID NO：3，SEQ ID NO：4，SEQ ID NO：5或SEQ ID NO：6所示的氨基酸序列，更优选地具有SEQ ID NO：3所示的氨基酸序列。

【技术特征摘要】
1.一种截短的HPV45L1蛋白，其与野生型HPV45L1蛋白相比，N端截短了30个、35个或40个氨基酸。2.权利要求1的截短的HPV45L1蛋白，其氨基酸序列如SEQIDNO：4、SEQIDNO：5或SEQIDNO：6所示。3.一种分离的核酸，其编码权利要求1或2的截短的HPV45L1蛋白。4.包含权利要求3的分离的核酸的载体。5.包含权利要求3的分离的核酸和/或权利要求4的载体的宿主细胞。6.一种HPV45病毒样颗粒，其含有权利要求1或2的截短的HPV45L1蛋白，或者由权利要求1或2的截短的HPV45L1蛋白组成。7.一种组合物，其包含权利要求1或2的截短的HPV45L1蛋白，或权利要求3的分离的核酸，或权利要求4的载体，或权利要求5的宿主细胞，或权利要求6的HPV45病毒样颗粒。8.一种药物组合物或疫苗，其包含权利要求6的HPV45病毒样颗粒，任选地还包含药学可接受的载体和/或赋形剂。9.权利要求8的药物组合物或疫苗，其中，所述HPV45病毒样颗粒以预防HPV感染或宫颈癌有效量存在。10.权利要求8或9的药物组合物或疫苗，其中，所述药物组合物或疫苗还包含至少一种选自下列的病毒样颗粒：HPV6L1蛋白病毒样颗粒，HPV11L1蛋白病毒样颗粒，HPV16L1蛋白病毒样颗粒，HPV18L1蛋白病毒样颗粒，HPV31L1蛋白病毒样颗粒，HPV33L1蛋白病毒样颗粒，HPV52L1蛋白病毒样颗粒和HPV58L1蛋白病毒样颗粒。11.获得截短的HPV45L1蛋白的方法，其包括利用大肠杆菌表达系统表达权利要求1或2的截短的HPV45L1蛋白，...

【专利技术属性】
技术研发人员：李少伟，李智海，李韵冰，王大宁，魏旻希，张军，夏宁邵，
申请(专利权)人：厦门大学，厦门万泰沧海生物技术有限公司，
类型：发明
国别省市：福建;35