重组的人乳头瘤病毒6型L1蛋白及其用途制造技术

本发明专利技术提供一种新的编码重组的HPV6L1蛋白的多核苷酸基因片段、包含该基因片段的载体、包括载体的宿主细胞，以及由该基因片段翻译表达的HPV6L1蛋白五聚体和由该五聚体组成的抗HPV6型感染的尖锐湿疣疫苗。

【技术实现步骤摘要】
【专利摘要】本专利技术提供一种新的编码重组的HPV6L1蛋白的多核苷酸基因片段、包含该基因片段的载体、包括载体的宿主细胞，以及由该基因片段翻译表达的HPV6L1蛋白五聚体和由该五聚体组成的抗HPV6型感染的尖锐湿疣疫苗。【专利说明】重组的人乳头瘤病毒6型LI蛋白及其用途
本专利技术涉及人类乳头状瘤病毒感染的预防和/或治疗。更具体而言，本专利技术涉及一种重组的人乳头瘤病毒6型LI蛋白，及由其组成的五聚体，含该蛋白的疫苗及其在预防HPV6型病毒感染，特别是在预防HPV6型病毒感染引起的尖锐湿疣疾病中的用途。
技术介绍
人类乳头状瘤病毒(Human Papillomavirus,简称HPV)是通过密切接触而传播的DNA病毒。在人体组织中，HPV主要感染皮肤和黏膜组织。HPV可分为高危险型和低危险型两种，长期持续感染高危型可以致癌，如宫颈癌，危害生命。低危型HPV可导致生殖器病变，如尖锐湿疣，影响生活质量。尖锐湿疣是由HPV感染所引起的较常见的性传播疾病。该病的发病率近年来持续上升，是仅次于淋病的第二位性病，并且其病情顽固，易复发，治疗困难。由于其发病率的增加，而日益受到人们的关注，其中至少有10个HPV亚型与尖锐湿疣有关，如6、11、16、18及33型，最通常的是6、11型，约占总发病率的90%。人乳头瘤病毒6型(HPV6)是尖锐湿疣的主要病因，而尖锐湿疣与HPV6感染之间又是单一的因果关系，这为用疫苗预防该病提供了可能。HPV属乳头多瘤空泡病毒科(Papovaviridae)乳头瘤病毒属，为无包膜DNA病毒。病毒基因组为双链闭环DNA，大小约为7.2~8kb，具有8个开放框。基因组按功能的不同可以分为三个区域:早期区(E)，约4.5kb，编码E1、E2、E4~E7共6个与病毒复制，转录及转化有关的非结构蛋白；晚期区(L)，约2.5kb，编码主要衣壳蛋白LI和次要衣壳蛋白L2;长调控区(LCR)，位于L区末端与E区起始端之间，长约800~900bp，不编码任何蛋白，含DNA复制、表达调控元件。HPV病毒颗粒直径为55~60nm，核衣壳呈20面体对称，由72个主要衣壳蛋白LI的五聚体及次要衣壳蛋白L2组成。大量研究证实，HPV LI蛋白是HPV疫苗的主要靶蛋白。在多种表达系统中表达的HPV LI蛋白无需L2蛋白辅助即可形成在形态结构与天然病毒颗粒相似的类病毒颗粒(Virus-LlkeParticle，VLP)。重组HPV Ll-VLP疫苗已经成功上市并用于预防HPV感染及由此导致的宫颈癌、尖锐湿疣等疾病，并充分证明了 Ll-VLP具有与野生同型病毒相同的抗原性和免疫原性。从组成VLP的三级结构看，其抗原决定簇均分布于组成VLP的基本结构单 元五聚体的表面(Xiaojiang S.Chen, Robert L.Garcea,Ilya Goldberg , Gregory Casini and Stephen C.(2000).HarrisonStructure of SmallVirus-like Particles Assembled from the LI Protein of Human Papillomavirus16.Molecular Cell, Vol.5，557 - 567.Brooke Bishop, Jhimli Dasguptaj MichaelKlein, Robert L Garceaj Neil D.Christensen, Rui Zhaoand Xiaojiang S.Chen.(2007).Crystal Structures of Four Types of Human Papillomavirus LI CapsidProteins.THE JOURNAL OF BIOLOGICAL CHEMISTRY VOL.282， N0.43， pp.31803 -31811)，说明HPV Ll-VLP的抗原性和免疫原性来源于或取决于LI组成的五聚体。因此，重组LI蛋白五聚体与VLP —样具备完整的抗原表位，也可以作为抗原用来制备疫苗。HPV疫苗研制的关键是能够大量高效制备HPV LI蛋白。目前较为常用的表达系统可以分为真核表达系统及原核表达系统。常用的真核表达系统有痘病毒表达系统、昆虫杆状病毒表达系统、酵母表达系统。在真核表达系统中所表达的HPV LI蛋白天然构象破坏少，能自发的形成VLP，往往只需进行简单的纯化即可获得VLP。但是由于真核表达系统的表达量低，培养成本高，给大规模工业化生产带来了极大困难。原核表达系统中利用大肠杆菌表达系统表达HPVLl蛋白已有报道。但是由于大肠杆菌所表达的HPV LI蛋白大多失去其天然构象，不能产生针对HPV的保护抗体。或者上述蛋白虽然通过包含体纯化，复性等步骤也可得到HPV VLP，但是在复性过程中蛋白损失量大，得率低，难以在大规模生产上应用。HPV LI全长序列蛋白虽然也可以在大肠杆菌中以正确构象可溶性地表达，溶解于菌体的裂解上清中，但是表达量较低，而且上清中杂蛋白种类多且量大，要从中纯化出目的蛋白难度相当大，依然无法应用于大规模生产。因此，本领域仍然需要成本低、纯度高、产量高、效果好的HPV LI蛋白生产技术和大规模工业化生产尖锐湿疣疫苗的新方法。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种新的HPV6 LI蛋白，及由其组成的五聚体蛋白颗粒及含该五聚体蛋白颗粒的疫苗。本专利技术涉及提供一种新的编码重组的HPV6 LI蛋白的多核苷酸基因片段、包含该基因片段的载体、包括载体的宿主细胞，以及由该基因片段翻译表达的HPV6 LI蛋白五聚体和由该五聚体组成的抗 HPV6型感染的尖锐湿疣疫苗。本专利技术公开了一种重组的HPV6 LI蛋白的氨基酸序列，所述蛋白的氨基酸序列在N端8-15个氨基酸全部或任意部分被2-10个氨基酸序列所取代，其氨基酸序列由G、S、A三者的任一组合方式；H4结构域被2-10个氨基酸序列取代，其氨基酸序列由G、S、A三者的任一组合方式。本专利技术涉及的HPV6 LI蛋白，进一步是其氨基酸序列C端截短O个、I个、2个至21个氨基酸。本专利技术所述的HPV6 LI蛋白，优选的被其氨基酸序列N端前8-15个氨基酸被GSGGG, ASASG或GSGAG取代，H4结构域优选的被GGGSG或GAGAS取代。如实施例所述的HPV6 LI蛋白，优选其氨基酸序列在N端前8、10、12或15个氨基酸优选被GSGGG或ASASG氨基酸序列取代。C端优选截短10-21个氨基酸，更优选截短10个、21个氨基酸。如实施例所述的HPV6 LI蛋白，其序列包含序列SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:4、SEQID NO:6、SEQ ID NO:8 或 SEQ ID NO:10。本专利技术公开一种编码蛋白的多核苷酸序列。本专利技术公开一种包含多核苷酸序列的基因的表达载体。本专利技术公开一种包含表达载体的细胞。本专利技术公开一种HPV6 LI蛋白五聚体，该蛋白五聚体由五个HPV6 LI蛋白单体形成。本专利技术公开一种HPV疫苗，该疫苗包括HPV6 LI蛋白五聚体和药用佐剂。本专利技术公开一种HPV疫苗的制备方法，该方法为: A.克隆或合成重组HPV6LI蛋白的基因片段； B.在大肠杆菌或酵母本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种重组的HPV6?L1蛋白，其特征在于所述蛋白的氨基酸序列在N端8?15个氨基酸全部或任意部分被2?10个氨基酸序列取代，其氨基酸序列由G、S、A三者的任一组合方式；H4结构域被2?10个氨基酸序列取代，其氨基酸序列由G、S、A三者的任一组合方式。

【技术特征摘要】
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【专利技术属性】
技术研发人员：刘永江，陈小江，陈林，盖大海，许铮，曹科，陈建平，潘勇昭，银飞，阮芳勇，
申请(专利权)人：北京康乐卫士生物技术股份有限公司，
类型：发明
国别省市：