【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于生物医药领域，具体涉及一种针对呼吸道合胞病毒(respiratorysyncytial virus，rsv)的重组亚单位疫苗及其应用，更具体涉及包含rsv病毒包膜融合蛋白f的head only(rhf)结构域和多聚化结构域例如免疫球蛋白fc片段的重组融合蛋白，包含所述重组融合蛋白的表达构建体，所述重组融合蛋白的制备方法，以及包括该重组融合蛋白的免疫原性组合物，例如疫苗。
技术介绍
0、专利技术背景
1、呼吸道合胞病毒(respiratory syncytial virus，rsv)易感人群包括儿童、老人和免疫力低下人群，其中儿童是主要受感染人群，年满2周岁时超过95％的儿童都感染过rsv。全球范围内，rsv感染是导致1个月至1岁的儿童死亡的主要原因，危害仅次于疟疾。rsv感染可能会导致严重的呼吸道症状，如毛细支气管炎、肺炎喉炎、气管炎、哮喘等。老年人感染rsv常导致阻塞性肺病恶化且伴有心肺并发症。每年与rsv病毒感染相关的治疗和护理成本达数十亿美元，给全球公共卫生系统带来了沉重的负担和挑战。
2、临床上，帕丽珠单抗(palivizumab)目前用于预防由rsv感染引起的严重疾病，特别是在早产或患先天性心脏病的婴幼儿中，但价格昂贵；尼塞维单抗(nirsevimab)于近期分别获欧洲药品管理局(ema)和美国食品药品管理局(fda)批准用于预防所有婴幼儿人群rsv相关下呼吸道疾病；利巴韦林被批准用于治疗婴幼儿rsv病毒感染所致的细支气管炎及肺炎，但疗效有限且副作用巨大。在疫苗方面，尽管有一些处于
3、rsv是一种包膜非节段负链rna病毒，属于肺炎病毒科(pneumoviridae)，正肺病毒属(orthopneumovirus)。rsv基因组共编码11种蛋白，其中g和f表面蛋白在rsv病毒吸附和融合过程中发挥重要作用，是诱导机体产生中和抗体最重要的抗原靶标，也是rsv病毒疫苗开发的主要靶点。rsv病毒的f蛋白是病毒包膜上丰富的i类融合糖蛋白，以三聚体“融合前”(prefusion)状态存在于病毒表面。一旦病毒开始侵染细胞，f蛋白的疏水融合环将插入宿主细胞膜，并经历广泛的构象变化，以折叠成能量上有利的三聚体“融合后”(postfusion)状态。
4、研究结果表明，相比融合后构象状态的f蛋白，稳定在融合前构象的f蛋白可以在动物模型中激活更强的中和抗体反应。例如，先前显示包含“ds-cav1”取代(155c、290c、190f和207l)、半胱氨酸拉链(cysteine zipper)和“sc-dm”取代(n67i，s215p)的重组rsv病毒f胞外域三聚体在动物模型中引发的中和抗体应答远高于基于融合后f蛋白制备的免疫原所诱导的免疫应答(structure-based design of a fusion glycoprotein vaccinefor respiratory syncytial virus(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/pmc4461862/)；a cysteine zipper stabilizes a pre-fusion f glycoprotein vaccinefor respiratory syncytial virus(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/pmc4476739/)；a highly stable prefusion rsv f vaccine derived from structuralanalysis of the fusion mechanism(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/pmc4569726/))。此外，人体rsv自然感染产生的中和免疫反应中，大部分是特异于融合前构象f蛋白的抗体，且通常是针对融合前构象f蛋白三聚体远膜端头部区域的强效抗原表位ф(zero)(neutralizing antibodies against the preactive form of respiratorysyncytial virus fusion protein offer unique possibilities for clinicalintervention(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/pmc3286924/))。
5、目前临床在研和获批上市的rsv疫苗均主要以融合前构象的f全长蛋白为抗原靶标，采用了重组蛋白、mrna和病毒载体疫苗等技术路线。基于f全长蛋白的重组rsv疫苗由于抗原可能转变为融合后构象而需进行冻干处理，mrna疫苗通常需在-20℃甚至-70℃以下储存和运输，病毒载体疫苗则存在生产工艺复杂、产量低且免疫原性不佳等缺陷。因此，本领域仍需开发安全有效、质量稳定的rsv疫苗，更理想的是能够聚焦强效抗原表位ф(zero)的rsv疫苗。
技术实现思路
0、专利技术简述
1、在一方面，本专利技术提供一种重组融合蛋白，其包含呼吸道合胞病毒(rsv)包膜融合蛋白f的head only(rhf)结构域和多聚化结构域。
2、在一些实施方案中，所述rsv f蛋白的rhf结构域包含rsv病毒强效抗原表位ф(zero)。
3、在一些实施方案中，所述重组融合蛋白的rsv强效抗原表位ф(zero)被维系在融合前构象状态。
4、在一些实施方案中，所述呼吸道合胞病毒(rsv)包膜融合蛋白f选自a亚型人rsv病毒f蛋白、b亚型人rsv病毒f蛋白或牛rsv病毒f蛋白，优选地，所述呼吸道合胞病毒(rsv)包膜融合蛋白f是a亚型a2株人rsv病毒f蛋白。
5、在一些实施方案中，所述rhf结构域包含rsv f蛋白的第一片段和第二片段，所述第一片段包含rsv f蛋白的约第50位-约第108位的氨基酸序列，且所述第二片段包含rsv f蛋白的约第145位-约第308位的氨基酸序列，所述氨基酸位置参考seq id no:1。
6、在一些实施方案中，所述rhf结构域包含rsv f蛋白的第一片段和第二片段，
7、1)所述第一片段包含rsv f蛋白的第50位-第108位的氨基酸序列，且所述第二片段包含rsv f蛋白的第145位-第308位的氨基酸序列，所述氨基酸位置参考seq id no:1；
8、2)所述第一片段包含rsv f蛋白的第50位-第108位的氨基酸序列，且所述第二片段包含rsv f蛋白的第145位-第305位的氨基酸序列，所述氨基酸位置参考seq id no:1；
9、3)所述第一片段包含rsv f蛋白的第50位-第108位的氨基酸序列，且所述第二片段包含rsv f蛋白的第1本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种重组融合蛋白，其包含呼吸道合胞病毒(RSV)包膜融合蛋白F的Head only(RHF)结构域和多聚化结构域。
2.权利要求1的重组融合蛋白，其中所述RSV F蛋白的RHF结构域包含RSV病毒强效抗原表位Ф(Zero)。
3.权利要求2的重组融合蛋白，其中所述重组融合蛋白的RSV强效抗原表位Ф(Zero)被维系在融合前构象状态。
4.权利要求1-3中任一项的重组融合蛋白，其中所述呼吸道合胞病毒(RSV)包膜融合蛋白F选自A亚型人RSV F蛋白、B亚型人RSV F蛋白或牛RSV F蛋白，优选地，所述呼吸道合胞病毒(RSV)包膜融合蛋白F是A亚型A2株人RSV病毒F蛋白。
5.权利要求1-4中任一项的重组融合蛋白，其中所述RHF结构域包含RSV F蛋白的第一片段和第二片段，所述第一片段包含RSV F蛋白的约第50位-约第108位的氨基酸序列，且所述第二片段包含RSV F蛋白的约第145位-约第308位的氨基酸序列，所述氨基酸位置参考SEQ ID NO:1。
6.权利要求1-5中任一项的重组融合蛋白，其中所述RHF结构
7.权利要求6的重组融合蛋白，其中所述第一片段包含SEQ ID NO:4所示氨基酸序列，且所述第二片段包含SEQ ID NO:5所示氨基酸序列；或所述第一片段包含SEQ ID NO:6所示氨基酸序列，且所述第二片段包含SEQ ID NO:7所示氨基酸序列。
8.权利要求1-7中任一项的重组融合蛋白，其中所述第一片段和第二片段通过接头相连。
9.权利要求8的重组融合蛋白，其中所述接头是长度为约3-约21个氨基酸的肽接头。
10.权利要求9的重组融合蛋白，其中所述肽接头是G(SG)n或G(PG)n或G(AG)n，其中n为1-10之间的整数，例如n＝1、2、3、4、5、6、7、8、9或10。
11.权利要求9或10的重组融合蛋白，其中所述肽接头选自GSG、GSGSG、GSGSGSGSG、GPGPG、GAGAG。
12.权利要求1-11中任一项的重组融合蛋白，其中所述RHF结构域包含：
13.权利要求12的重组融合蛋白，其中所述RHF结构域相对于野生型序列包含氨基酸取代
14.权利要求1-13中任一项的重组融合蛋白，其中所述RHF结构域还进一步包含在第67位的I(67I)和/或在第215位的P(215P)，所述氨基酸位置参考SEQ ID NO:1。
15.权利要求14的重组融合蛋白，其中所述RHF结构域相对于野生型序列还进一步包含氨基酸取代N67I和/或S215P，所述氨基酸位置参考SEQ ID NO:1。
16.权利要求1-15中任一项的重组融合蛋白，其中所述RHF结构域包含SEQ ID NO:8-10之一所示的氨基酸序列或与SEQ ID NO:8-10之一具有至少80％、90％、95％、96％、97％、98％、99％、99.5％序列相同性的氨基酸序列。
17.权利要求1-16中任一项的重组融合蛋白，其中所述多聚化结构域直接或通过接头连接至所述RHF结构域的C末端。
18.权利要求1-17中任一项的重组融合蛋白，其中多聚化结构域选自免疫球蛋白的Fc片段、T4噬菌体的Foldon序列、铁蛋白(Ferritin)亚基。
19.权利要求1-18中任一项的重组融合蛋白，其中所述多聚化序列是T4噬菌体的Foldon序列，例如，所述T4噬菌体的Foldon序列包含SEQ ID NO:11所示氨基酸序列。
20.权利要求1-18中任一项的重组融合蛋白，其中所述多聚化结构域是免疫球蛋白的Fc片段。
21.权利要求20的重组融合蛋白，其中所述免疫球蛋白的Fc片段是人、小鼠、兔子、牛、山羊、猪、兔、仓鼠、大鼠、或豚鼠的免疫球蛋白的Fc片段；或
22.权利要求20或21的重组融合蛋白，所述免疫球蛋白Fc片段包含SEQ ID NO:12或13所示氨基酸序列。
23.权利要求1-22中任一项的重组融合蛋白，其中所述重组融合蛋白包含SEQ ID NO:14-22之一所示的氨基酸序列或与SEQ ID NO:14-22之一具有至少80％、90％、95％、96％、97％、98％、99％、99.5％序列相同性的氨基酸序列。
24.一种分离的核酸分子，其包含编码权利要求1-23任一项所述的重组融合蛋白的核苷酸序列。
25.权利要求24的分离的核酸分子，其中所述编码权利要求1-23任一项所述的重组融合蛋白的核苷酸序列针对用于...
【技术特征摘要】
1.一种重组融合蛋白，其包含呼吸道合胞病毒(rsv)包膜融合蛋白f的head only(rhf)结构域和多聚化结构域。
2.权利要求1的重组融合蛋白，其中所述rsv f蛋白的rhf结构域包含rsv病毒强效抗原表位ф(zero)。
3.权利要求2的重组融合蛋白，其中所述重组融合蛋白的rsv强效抗原表位ф(zero)被维系在融合前构象状态。
4.权利要求1-3中任一项的重组融合蛋白，其中所述呼吸道合胞病毒(rsv)包膜融合蛋白f选自a亚型人rsv f蛋白、b亚型人rsv f蛋白或牛rsv f蛋白，优选地，所述呼吸道合胞病毒(rsv)包膜融合蛋白f是a亚型a2株人rsv病毒f蛋白。
5.权利要求1-4中任一项的重组融合蛋白，其中所述rhf结构域包含rsv f蛋白的第一片段和第二片段，所述第一片段包含rsv f蛋白的约第50位-约第108位的氨基酸序列，且所述第二片段包含rsv f蛋白的约第145位-约第308位的氨基酸序列，所述氨基酸位置参考seq id no:1。
6.权利要求1-5中任一项的重组融合蛋白，其中所述rhf结构域包含rsv f蛋白的第一片段和第二片段，
7.权利要求6的重组融合蛋白，其中所述第一片段包含seq id no:4所示氨基酸序列，且所述第二片段包含seq id no:5所示氨基酸序列；或所述第一片段包含seq id no:6所示氨基酸序列，且所述第二片段包含seq id no:7所示氨基酸序列。
8.权利要求1-7中任一项的重组融合蛋白，其中所述第一片段和第二片段通过接头相连。
9.权利要求8的重组融合蛋白，其中所述接头是长度为约3-约21个氨基酸的肽接头。
10.权利要求9的重组融合蛋白，其中所述肽接头是g(sg)n或g(pg)n或g(ag)n，其中n为1-10之间的整数，例如n＝1、2、3、4、5、6、7、8、9或10。
11.权利要求9或10的重组融合蛋白，其中所述肽接头选自gsg、gsgsg、gsgsgsgsg、gpgpg、gagag。
12.权利要求1-11中任一项的重组融合蛋白，其中所述rhf结构域包含：
13.权利要求12的重组融合蛋白，其中所述rhf结构域相对于野生型序列包含氨基酸取代
14.权利要求1-13中任一项的重组融合蛋白，其中所述rhf结构域还进一步包含在第67位的i(67i)和/或在第215位的p(215p)，所述氨基酸位置参考seq id no:1。
15.权利要求14的重组融合蛋白，其中所述rhf结构域相对于野生型序列还进一步包含氨基酸取代n67i和/或s215p，所述氨基酸位置参考seq id no:1。
16.权利要求1-15中任一项的重组融合蛋白，其中所述rhf结构域包含seq id no:8-10之一所示的氨基酸序列或与seq id no:8-10之一具有至少80％、90％、95％、96％、97％、98％、99％、99.5％序列相同性的氨基酸序列。
17.权利要求1-16中任一项的重组融合蛋白，其中所述多聚化结构域直接或通过接头连接至所述rhf结构域的c末端。
18.权利要求1-17中任一项的重组融合蛋白，其中多聚化结构域选自免疫球蛋白的fc片段、t4噬菌体的foldon序列、铁蛋白(ferritin)亚基。
19.权利要求1-18中任一项的重组融合蛋白，...
【专利技术属性】
技术研发人员：蒋敦泉，刘永江，张士彬，黄培鑫，陈君娜，阴雅洁，刘玉莹，张欢，江萍，银飞，姜绪林，张尧，沈迩萃，杨秀芬，王艳，高俊，
申请(专利权)人：北京康乐卫士生物技术股份有限公司，
类型：发明
国别省市：
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