本发明专利技术涉及了一种miR-29吸收序列、吸收载体及其用途。本发明专利技术的miR-29吸收载体携带从5’至3’依次包含如下元件的表达盒：(a)II型启动子；(b)指示蛋白编码序列；(c)miR-29吸收序列，所述吸收序列是4～10次重复的、与miR-29部分互补或完全互补的序列；(d)任选的增强子序列。本发明专利技术还提供了所述吸收载体的应用及包含该载体的药物组合物。本发明专利技术的miR-29吸收载体可用于预防和治疗胞内菌感染导致的炎症、Th1型反应、结核等疾病。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于生物技术和医学领域。具体而言，本专利技术涉及miR-29吸收载体的制备及应用，尤其是miR-29相关疾病中的应用，例如在细菌感染(尤其是胞内菌感染)中的效应、作用机制、实施方法和用途。
技术介绍
Mi croRNA (miRNA)是长约20 24nt、非编码的微小RNA，它们通过抑制mRNA翻译或者促进mRNA降解对靶基因进行转录后水平的调控(Bartel，D. P.，Cell. 2004,116 281-297)。MiRNA几乎控制着每一个生物学过程，包括细胞的分化、发育、增殖和凋亡。此夕卜，miRNA表达水平失调与肿瘤等疾病也密切相关(Lu，J.等，Nature. 2005，435 :834-838 ；Li, Q. J.等，Cell. 2007，129 :147-161 ；Cheng, H. Y.等，Neuron. 2007,54 :813-829 ；Ch·ang,T. C.等，Mo I Cell. 2007,26 :745-752 ；He, L.等，Nature. 2005，435 :828-833 ；Care, A.等，Nat Med. 2007，13 :613-618)。在诸多已被广泛报道的miRNA中，miR-29应该算是一种明星分子，根据已有的50多个miR-29相关的报道中，其作用涉及了肿瘤、血液造血系统疾病、神经系统疾病、呼吸系统疾病、循环系统疾病、风湿病、糖尿病、皮肤病、病毒感染以及骨分化、肌肉分化和肌肉相关疾病等诸多人类重大疾病，这也从一个侧面体现出这种miRNA在生理病理过程中发挥的重要作用。此外，即便在肿瘤中，miR-29也体现出截然不同的功能，它既可作为癌基因，亦可被视为抑癌基因。同时，根据计算机预测结果，miR-29可以靶向免疫信号通路中的多个信号分子或者接头蛋白而参与免疫反应和免疫细胞分化和发育过程的调控。急性髓性白血病病人的外周血淋巴细胞中，miR-29表达下调(Garzon, R.等，Blood. 2009,114 5331-5341)，miR-29b的寡核苷酸模拟物已被证明可靶向凋亡、细胞周期和增殖等多条通路而可用于治疗急性髓性白血病(Garzon,R.等，Blood. 2009，114 :6411-6418 ；Garzon,R.等，Blood. 2009，114 :5331-5341)。申请人之前的研究发现细菌感染如李斯特菌、结核分支杆菌感染后，NK和T细胞被活化而其中的miR-29a表达下调，进一步实验证实，抑制细胞内源性的miR-29a可促进这些细胞产生更多的IFN-Y，而IFN-Y在机体抗胞内菌过程中至关重要。MiRNA吸收载体或者miRNA诱饵载体，能够通过吸收或扣押内源性的目的miRNA而实现抑制miRNA的功能，miRNA吸收载体的抑制功能远远强于化学合成的寡核苷酸抑制剂(Ebert, M. S.和 Sharp, P. A.，RNA. 2010，16 :2043-2050)。并且，相对于化学合成的寡核苷酸抑制剂，miRNA吸收载体在应用时具有很多优势比如可以制备成病毒载体而在难以转染的细胞基因高表达，甚至在体内高表达该载体；可以用于制备稳转细胞系或者转基因动物模型；可以通过更换细胞特异性的启动子而使其在某些细胞中特异性表达；其次，由于它可以同时吸收同一家族的miNRA，故比只能吸收完全互补的某一种miRNA的寡核苷酸抑制剂更加强大，更能避免miRNA的功能冗余现象；miRNA吸收载体较化学修饰的miRNA抑制剂价格便宜、稳定性高。IFN-Y是Thl细胞标志性的细胞因子，在抗感染免疫，尤其是抗李斯特菌和抗结核杆菌相关的固有免疫和获得性免疫中起着至关重要的作用(Schoenborn，J. R.和Wilson, C. B. , Adv Immunol. 2007,96 :41-101)。李斯特菌存在于日常食物中，对免疫缺陷或者免疫耐受的人来说是潜在的危险，因为李斯特菌能诱导败血症和脑膜炎，还能引起孕妇的脓毒性流产(Pamer，E.G.，Nat RevImmunol. 2004,4 :812-823)。李斯特菌感染早期的防御主要靠NK细胞分泌的IFN- Y以及随之活化的巨噬细胞(Pamer, E. G.，Nat Rev Immunol. 2004,4 :812-823)。结核病已是全球最主要的公共卫生问题之一，但有效预防和治疗的手段尚待开发(Corbett,E. L.等,Arch Intern Med. 2003,163 :1009-1021)。结核分支杆菌的致死性主要与细菌的增殖、过度的炎症和继发的组织损伤相关(North，R. J.和Jung，Y. J.，Annu RevImmunol. 2004，22 :599-623 ；Dorhoi,A.等，J Exp Med. 2010，207 :777-792)，而宿主抗结核 菌的免疫反应主要靠Thl细胞(Mogues, T.等，J Exp Med. 2001，193 :271-280)。因此，结核菌持续性感染的机制以及如何有效激活免疫系统以抵抗结核菌的研究，将有助于设计、应用结核菌的防治策略。在多个动物模型以及人类疾病中已充分证实Thl细胞及其分泌的IFN-Y在抗结核分支杆菌感染过程中起主要作用(Redford, P. S.等，Eur J Immunol. 2010,40 2200-2210)。另一方面，IFN-Y也参与了某些免疫疾病的病理过程。因此，探讨调控IFN-Y的机制，可以帮助我们了解怎样更好地保护机体抗胞内病原菌感染，以及限制过度炎症反应引起的组织损伤。本领域中迫切需要开发出有效治疗或预防miR-29相关疾病(尤其是感染或结核病等)的新药物。
技术实现思路
本专利技术的目的之一正是提供了一种miR-29吸收序列或载体，及其在有效抵抗细菌感染、预防和治疗胞内菌感染性疾病中的新用途。本专利技术的另一目的是提供这种新型miR-29新型载体的作用原理及在抗胞内菌感染过程中的免疫学原理。本专利技术的又一目的是提供了这种新型吸收载体在抗细菌感染中的用途和实施策略，特别是应用于胞内菌感染导致的炎症、Thl型反应、结核等疾病的预防和治疗。本专利技术提供的miR-29吸收载体可以促进胞内菌感染后IFN-Y的产生，减少肝脏、肺脏、脾脏等脏器中细菌的残留量，提高机体的存活率。在本专利技术的第一方面中，提供了一种miR-29吸收载体，其携带从5’至3’依次包含如下元件的表达盒(a) II型启动子；(b)指示蛋白编码序列；(c)miR-29吸收序列，所述吸收序列是4 10次重复的、与miR-29部分互补或完全互补的序列；(d)任选的增强子序列。在一优选例中，miR-29吸收载体中的表达盒自5’至3’依次为UBC启动子、eGFP指不蛋白及其在终止码后插入的miR-29吸收序列。在本专利技术的一个实施方式中，所述II型启动子优选UBC、CAG、PGK、CMV启动子。在一个优选例中，所述UBC启动子优选为Human Ubiquitin C序列(SEQ ID NO:18)或其同源序列。在另一个优选例中,所述启动子是细胞特异性启动子或广泛表达的启动子。在本专利技术的另一个实施方式中，所述指示蛋白选自荧光蛋白、萤光素酶或者表达标签。在一个优选例中，本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种miR？29吸收载体，其携带从5’至3’依次包含如下元件的表达盒：(a)II型启动子；(b)指示蛋白编码序列；以及(c)miR？29吸收序列，所述吸收序列是4～10次重复的、与miR？29部分互补或完全互补的序列；(d)任选的增强子序列。
【技术特征摘要】
1.一种miR-29吸收载体，其携带从5’至3’依次包含如下元件的表达盒 (a)II型启动子； (b)指示蛋白编码序列；以及 (c)miR-29吸收序列，所述吸收序列是4 10次重复的、与miR-29部分互补或完全互补的序列； (d)任选的增强子序列。2.如权利要求I所述的miR-29吸收载体，其特征在于，所述II型启动子优选UBC、CAG、PGK、CMV 启动子。3.如权利要求I所述的miR-29吸收载体，其特征在于，所述指示蛋白选自荧光蛋白、萤光素酶或者表达标签。4.如权利要求I所述的miR-29吸收载体，其特征在于，所述吸收序列与miR-29的互补比例为78% 84%。5.如权利要求I所述的miRNA吸收载体，其特征在于，所述miR-29吸收序列选自下组如SEQ ID NO :3所示的序列；由SEQ ID NO :3所示序列经过取代、缺失或添加一个或几个核苷酸、且具有预防或治疗miR-29过表达相关疾病和/或征状的活性的序列；或它们的互补序列。6.如权利要求I所...
【专利技术属性】
技术研发人员：曹雪涛，马烽，李楠，徐胜，
申请(专利权)人：中国人民解放军第二军医大学，
类型：发明
国别省市：
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