本发明专利技术涉及同向串联共表达双色荧光蛋白报告基因载体pDsRed2-MCS-EGFP。它是在载体pIRES2-EGFP的基础上，经PCR反应获得缺失IRES和EGFP序列的载体骨架pΔSG，构建其T载体克隆psT-ΔSG，酶切后与同步酶切的、携带附加优化MCS序列的荧光蛋白报告基因DsRed2、EGFP进行连接、亚克隆而得。将待分析目的DNA序列定向克隆入pDsRed2-MCS-EGFP的MCS区，获得的重组质粒转染相应宿主细胞，DsRed2的本底表达指示转染效率，EGFP的表达有赖MCS区目的DNA序列的活性，其表达与否及表达量的多少，皆作为指征目的DNA序列是否具有相应生物活性及其高低。优化的MCS序列适合更广泛的基因克隆操作；DsRed2和EGFP表达的检测时效范围宽，且相互独立、互为表征，成像效果清晰、鲜明，使实验操作更简便，结果更具说服力。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及同向串联共表达双色荧光蛋白报告基因载体，是用于鉴定外源目的DNA片段是否具有启动转录或起始翻译功能的载体质粒。
技术介绍
含有筛选标记的转基因载体在基因工程中具有广泛的用途。常见转基因载体包含有一个或多个筛选标记或报告基因，以方便对插入外源核苷酸片段重组质粒的筛选和鉴定。其中荧光蛋白基因在活细胞中的表达产物具有生物活性稳定、信号特异性强、有效活性维持时间长、方便检测和对外源目的基因表达活性干扰小等特点，所以常利用荧光蛋白基因的表达来研究外源核苷酸片段的功能。通常情况下，同一报告基因载体中仅含有一个荧 光蛋白基因，将目的DNA片段克隆到荧光蛋白基因的N端或C端，构建的重组质粒转染相应宿主细胞，通过检测荧光蛋白的表达即可判定目的核酸片段是否具有相应功能，但难以同步反映重组报告基因质粒的转染效率和判定目的DNA的生物功能。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种同向串联共表达双色荧光蛋白报告基因载体pDsRed2-MCS-EGFP，2012年07月06日送藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址是北京市朝阳区北辰西路I号院3号，分类命名大肠埃希氏菌(Escherichiacoli)，保藏号 CGMCC 6320。本专利技术构建同向串联共表达双色荧光蛋白的报告基因载体所采用的技术方案是利用基因克隆技术，在亲本载体PIRES2-EGFP启动子pCMV后的Bgl II位点与SV40polyA序列之间置换入如下DNA序列自5'至3'方向依次插入红色荧光蛋白基因DsRed2、优化组合的多克隆酶切位点MCS(包括Sal I,Spe I,Sca I,Pvu I、Nhe I,Mlu I,EcoR I,Xba I,BamHI、Sac II, Sac I, Sma I和EcoR V，其中Nhe I为非单克隆位点)、绿色荧光蛋白基因EGFP和Xho I位点序列(如SEQN0. I中的第609-2085nt)，获得如SEQN0. I (第l_5408nt)所示核苷酸序列的同向串联共表达双色荧光蛋白的新型报告基因载体质粒pDsRed2-MCS-EGFP。所述同向串联共表达双色荧光蛋白的报告基因载体的DNA分子也属于本专利技术的保护范围。含有所述载体分子、所述重组报告基因载体的转基因重组菌或细胞也属于本专利技术的保护范围。本专利技术的同向串联共表达双色荧光蛋白报告基因载体具备经直接酶切、连接构建插入目的DNA的重组报告基因质粒及转染细胞等简单操作，就可以用于分析和鉴定插入目的DNA序列生物活性的功用；由pCMV启动转录的多顺反子mRNA中，上游红色荧光蛋白的表达指示转染效率，下游绿色荧光蛋白的表达与否及其产量反映目的DNA序列是否具有相应生物活性及其活性高低。附图说明图I同向串联共表达双荧光蛋白报告基因载体pDsRed2-MCS-EGFP的构建图谱。图2载体骨架P Λ SG的PCR扩增与克隆鉴定电泳图谱。图3构建同向串联共表达双荧光蛋白报告基因载体pDsRed2-MCS-EGFP的电泳图-i'TfeP曰。图4重组报告基因质粒PDsRed2-LTR-EGFP的酶切鉴定电泳图谱。图5各质粒转染CHO细胞的荧光检测结果。 具体实施例方式下述实施例中如无特殊说明，所用方法均为常规基因克隆方法，所用试剂均可经商业途径购得。实施例I.构建同向串联共表达双色荧光蛋白报告基因载体pDsRed2-MCS_EGFP(I)载体骨架P Λ SG的PCR扩增与克隆在载体pIRES2-EGFP(PT3267-5，Clontech)的基础上，设计含有linker序列的引物P Λ SG F、P Λ SG R扩增缺失IRES和EGFP基因片段的载体骨架ρ Λ SG (包括pCMV、PUCori、Kan/Neo、SV40polyA 功能或基因序列)。P ASG F 5/ -CGCCTCGAGTCTAGATCATAATCAGCCATACC-3'，(含有 XhoI、XbaI 的识别位点)；ρ ASG R 5/ -CCGGATATCGAATTCGAAGCTTGAGC-3'，(含有 EcoR I、EcoR V 的识别位点)。25 μ I 反应体系的组成是双蒸水 15. O μ 1，Ex Taq IOXBuffer 2. 5 μ 1，dNTPs2.O μ I,MgCl2L 5 μ l，pASG Fl. O μ l，pASG R I. O μ l，pIRES2_EGFPTE 溶液 I. O μ I,ExTaq1.O μ I。PCR扩增条件是 95°C 5min ；95°C 50sec,55°C 50sec,72°C 5min，共 32 个循环；最后经72°C IOmin充分延伸后冷却至4°C保存。PCR产物经O. 8 %琼脂糖凝胶电泳分离大小为3975bp的ρ Λ SG PCR产物，切胶同收后与pMD 18-TSimple Vector连接构建重组克隆psT- Δ SG。经常规转化经CaCl2制备的DH5a感受态细胞，涂布含Ampicillin的LB固体平板，37°C过夜培养。到时选取平板上优势抗性生长的单菌落，用引物ρ Λ SG F, ρ Δ SG R做菌落PCR检测。初步检测为阳性的克隆菌落经挑菌，在含Ampicillin的LB液体培养基中过夜扩增后送商业公司测序。提取结果正确的克隆样品的质粒进行EcoR I、XhoI双酶切和Bgl II单酶切反应，鉴定载体质粒PsT- Δ SG。psT- Δ SG经EcoRI和XhoI双酶切出2710bp和3957bp两条带，经Bgl II单酶切出6667bp的一条带。克隆、鉴定psT-Λ SG的电泳结果如图2所示。图2中，I.扩增ρ Λ SG的PCR产物、2.菌落PCR鉴定ρΛ SG的扩增结果、3. psT-Λ SG经EcoR I和XhoI双酶切产物、4. psT-Λ SG经 Bgl II 单酶切产物、5. DNA MarkerDL15000.(2)构建同向串联共表达双色荧光蛋白报告基因载体质粒pDsRed2-MCS-EGFP在载体pDsRed2-Cl(PT3603_5，Clontech)的基础上，设计引物 DsRed2F、DsRed2R扩增红色荧光蛋白基因DsRed2(723nt)。DsRed2F :5'-CAGATCTACCATGGCCTCCTCCGAGAAC-3'，(含有 Bgl II 识别位点);DsRed2R 5'-GAATTCACGCGTGCTAGCGATCGAGTACTAGTCGACTACAGGAACAGGTGGTGGCGGC-3'，(含有Sal I、Spe I、ScaI、PvuI、独§1、MluI和EcoRI识别位点，其中NhsL不是单克降酶切位点)。PCR 反应体系是双蒸水 15·0μ 1，ExTaq 10XBuffer2. 5 μ I, dNTPs 2. Ομ I,MgCl2L 5 μ I, DsRed2F I. O μ I, DsRed2R I. O μ 1，pDsRed2_ClTE 溶液 1.0 μ 1，Ex TaqI. O μ I。PCR 扩增条件是 95°C 5min ；95°C 50sec, 55°C 50sec, 72V 50sec，共 32 个循环；最后经72°C IOmin充分延伸后冷却本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种DNA分子，其特征是：经优化MCS序列串联的可同向串联共表达双色荧光蛋白报告基因载体质粒pDsRed2？MCS？EGFP，具有SEQ？NO.1中第609？2085nt的DNA序列。
【技术特征摘要】
1.一种DNA分子，其特征是经优化MCS序列串联的可同向串联共表达双色荧光蛋白报告基因载体质粒pDsRed2-MCS-EGFP，具有SEQ NO. I中第609_2085nt的DNA序列。2.含有权利要求I所述报告基因载体质粒的构建方法。3.根据权利要求2所述的报告基因载体质粒，其特征在于pCMV下游连接有优化MCS串联表达的双色荧光蛋白报告基因序列DsRed2-MCS-...
【专利技术属性】
技术研发人员：王玉，于爱莲，姜世金，施鲁笛，
申请(专利权)人：泰山医学院，
类型：发明
国别省市：
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