本发明专利技术公开了一种利用pCold-sumo表达载体高效表达PCV?2?Cap蛋白的方法，该方法包括以下步骤：抽提PCV?2病毒的DNA，扩增得到PCV?2去核定位信号肽的Cap蛋白的基因片段；将扩增片段连接到pCold-SUMO质粒中，构建重组质粒pCold-SUMO-dCap；将重组质粒转化大肠杆菌ArcticExpress?Escherichia?coli，然后低温诱导表达，表达产物经纯化后得到可溶性的sumo-dCap融合蛋白。本发明专利技术的方法能成功克服PCV?2?Cap蛋白在大肠埃希菌中不表达或是表达量极低的难题；本发明专利技术方法所表达的Cap蛋白主要以可溶性形式存在、纯化方法简单可行、纯化效果很好、具有很好的免疫学反应原性，可以应用于流行病学诊断方法的建立及疫苗的研究。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于基因工程领域，具体涉及一种利用pCold-sumo表达载体高效表达猪圆环病毒2型(PCV2)的缺失核定位信号肽的Cap蛋白的方法。
技术介绍
猪圆环病毒2型(Porcine circovirus type2,PCV2)是近年来新发现的一种重要病原微生物，该病毒被认为是断乳仔猪多系统衰竭综合征(Post-weaning multisystemicwasting syndrome,PMWS)的主要病原(Allan, Meehan et al. 1998)。PCV2 的感染，会使动物机体产生免疫抑制，使机体的免疫抵抗力下降，造成其它病原的继发感染，从而引起更加严重的临床症状。PCV2除了引起PMWS而外，还可导致猪皮炎/肾病综合征(Porcine dermatitis and nephropathy sundrome, PDNA)、猪呼吸道病复合症(Porcine respiratorydisease complex, PRDC)等相关疾病(Allan, McNeilly et al. 2000;Kim, Chung etal. 2003; Ramamoorthy and Meng2009)。PMWS自1991年首次在加拿大被发现，目前多个国家和地区存在该病的流行(Kennedy and Allanl998)。PCV2感染引起的相关疾病在我国的流行情况也十分严重(朗洪武，张广川等.2000;张朝霞，刘长明等.2008)。虽然目前市场上开始出现可以预防PCV2感染的疫苗，但是其价格高昂，大部分猪场无力使用，并且其质量参差不齐，猪场仍然无控制和消灭pCV2感染的有效措施。所以PCV2给我国养猪业造成了巨大的经济损失。PCV2基因组为单股环状负链DNA，全长为1767bp或1768bp。PCV2的基因组共编码11个开放阅读框架(open reading frames, ORFs),其中功能上重要的是ORFl和0RF2。ORFl 编码与病毒 DNA 滚环复制相关的 Rep 蛋白(Mankertz, Mankertz et al. 1998)。ORF2共有702个核苷酸，位于基因组互补链上，编码病毒的核衣壳蛋白，即Cap蛋白。Cap蛋白是PCV2病毒粒子唯一的结构蛋白，蛋白分子量大小约32kDa，同时也是PCV2主要的免疫原性蛋白。Cap蛋白的N端65 87aa、113 147aa、157 183aa区域及C端4个氨基酸为病毒的主要抗原位点。其中N端69 83aa和117 131aa两个抗原位点具有针对PCV2型特异性，能被PCV2多抗所识别，N端157 183aa抗原位点为PCVl和PCV2共同具有。虽然PCVl和PCV2的Cap蛋白存在一个共同的抗原位点，但血清学实验结果显示，两种血清型的Cap蛋白之间不存在抗原交叉性，这可能是因为整个Cap蛋白掩盖了其共同的抗原位点。Cap蛋白经体外表达后，能自我组装成类病毒样颗粒，具有PCV2病毒粒子的免疫学特性，在流行病学诊断及疫苗的研究中具有十分重要地位，因此Cap蛋白在体外的高效表达是PCV2的研究热点。Cap蛋白的N端有一段由41个氨基酸组成的核定位信号肽(nuclearlocalization signal,NLS) (Liu, Tikoo et al. 2001),该 NLS 核酸序列含有约 30% 的大肠埃希菌(E. coli)稀有密码子(Trundova and Celer2007),严重阻碍Cap蛋白在大肠埃希菌表达系统中的有效表达(Lou，Li et al.2011)。另外，目前Cap蛋白在原核表达系统中的表达情况多以包涵体形式表达(Kong, Kong et al.2011;赵玲，朱玲等.2011),对蛋白的纯化带来不便，其反应原性和免疫原性亦不如可溶性蛋白好。所以，目前Cap蛋白的体外有效表达、纯化是Cap蛋白应用于流行病学诊断及疫苗的研究中急需攻克的难点。
技术实现思路
为了克服现有方法中Cap蛋白表达量低、表达产物以包涵体形式存在给后续纯化带来诸多不便，以及表达产物的反应原性和免疫原性不如可溶性蛋白好等缺陷，本专利技术的目的在于提供一种利用pCold-sumo表达载体高效表达PCV2缺失核定位信号肽的Cap蛋白的方法，该方法能够高效表达可溶性的猪圆环病毒2型缺失核定位信号肽的Cap蛋白，并且表达产物的免疫学反应活性更佳。本专利技术的目的通过下述技术方案实现—种,包括以下步骤 (I)抽提PCV2病毒的DNA ;根据PCV 2 0RF2的序列设计引物，扩增得到PCV2去核定位信号肽的Cap蛋白的基因片段；(2)将步骤(I)扩增得到的基因片段连接到pCold-SUMO质粒中，构建重组质粒pCold-SUMO-dCap ；(3)将重组质粒 pCoId-SUMO-dCap 转化大肠杆菌 ArticExpress Escherichiacoli,得到重组大肠杆菌Artic Exp. E. coli / pCold-Sumo-dCap ;然后对重组大肠杆菌Artic Exp. E. coli / pCold-Sumo-dCap低温诱导表达,表达产物经纯化后得到可溶性的sumo-dCap融合蛋白；步骤(I)所述的引物，其序列为引物PI : 5，-ATCAggatccAATGGCATCTTCAACACCCG-3，；引物P2 :5 ’ -ATCACTGCAGTTAAGGGTTAAGTGGGGGGTCTTT-3，；步骤(2)所述的将步骤(I)扩增得到的基因片段连接到pCold-SUMO质粒中，是将扩增片段插入到pCold-SUMO质粒的BamHI与PstI克隆位点；步骤(3)所述的重组大肠杆菌Artic Exp. E. coli/pCold-Sumo-dCap 已于 2012年5月4日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(北京市朝阳区北辰西路I号院3号中国科学院微生物研究所)，保藏号为CGMCC 6080，分类命名是大肠埃希氏菌Escherichia coli ；步骤(3)所述的低温优选15°C ;步骤(3)所述的纯化是用NI-NTA树脂纯化。本专利技术的机理是由于PCV2主要抗原位点均不在Cap蛋白的NLS区域，NLS对PCV2主要起细胞核内定位作用，因而在表达Cap蛋白的过程中，本专利技术通过将NLS序列截除以实现Cap蛋白的有效表达。为了实现异源性蛋白在E. coli中的可溶性表达,各种表达元件被应用在蛋白表达过程中，包括增加启动子、融合标签，优化菌体生长环境，密码子优化等。其中融合标签的作用效果较为明显，例如SUMO标签及pET表达载体中的Nus、Trx、GST标签等。本专利技术通过选择带有SUMO标签的pCold-sumo表达载体以实现Cap蛋白在E. coli中的高效可溶性表达。本专利技术相对于现有技术具有如下的优点及效果I、本专利技术的方法能成功克服PCV2 Cap蛋白在大肠埃希菌中不表达或是表达量极低的难题。2、本专利技术方法表达的Cap蛋白主要以可溶性形式存在。3、本专利技术方法表达的Cap蛋白的纯化方法简单可行，纯化效果很好。4、Westernblot分析结果证明，本专利技术方法表达的Cap蛋白具有很好的免疫学反应原性，可以应用于流行病学诊断方法的建立及疫本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种利用pCold？sumo表达载体高效表达PCV？2？Cap蛋白的方法，其特征在于包括以下步骤：（1）抽提PCV2病毒的DNA；根据PCV？2？ORF2的序列设计引物，扩增得到PCV2去核定位信号肽的Cap蛋白的基因片段；（2）将步骤（1）扩增得到的基因片段连接到pCold？SUMO质粒中，构建重组质粒pCold？SUMO？dCap；（3）将重组质粒pCold？SUMO？dCap转化大肠杆菌ArticExpress？Escherichia？coli，得到重组大肠杆菌Artic？Exp.E.coli／pCold？Sumo？dCap；然后对重组大肠杆菌Artic？Exp.E.coli／pCold？Sumo？dCap低温诱导表达，表达产物经纯化后得到可溶性的sumo？dCap融合蛋白；步骤（1）所述的引物，其序列为：引物P1：5’？ATCAGGATCCAATGGCATCTTCAACACCCG？3’；引物P2：5’？ATCACTGCAGTTAAGGGTTAAGTGGGGGGTCTTT？3’。
【技术特征摘要】
1.ー种利用pCold-sumo表达载体高效表达PCV 2 Cap蛋白的方法,其特征在于包括以下步骤 (1)抽提PCV2病毒的DNA;根据PCV 2 0RF2的序列设计引物，扩增得到PCV2去核定位信号肽的Cap蛋白的基因片段； (2)将步骤(I)扩增得到的基因片段连接到pCold-SUMO质粒中，构建重组质粒pCold-SUMO-dCap ； (3)将重组质粒pCold-SUMO-dCap 转化大肠杆菌 ArticExpress Escherichia coli,得到重组大肠杆菌Artic Exp. E. coli / pCold-Sumo-dCap ;然后对重组大肠杆菌Artic Exp.E. coli / pCold-Sumo-dCap低温诱导表达,表达产物经纯化后得到可溶性的sumo_dCap融合蛋白； 步骤(I)所述...
【专利技术属性】
技术研发人员：樊惠英，廖明，陈春丽，叶昱，张杰，
申请(专利权)人：华南农业大学，
类型：发明
国别省市：
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