本发明专利技术公开了一种用于重组蛋白分泌型表达的双基因突变大肠杆菌的构建方法使用预先设计的细胞膜蛋白和细胞壁合成酶基因的双敲除基因的引物进行PCR反应，得到两端为10～250bp特定目标基因同源序列及中间为抗性标记序列的双敲除基因的基因打靶片段，并分别通过电转化整合到宿主大肠杆菌染色体中，得到双基因突变的分泌型大肠杆菌菌株。本发明专利技术提高重组外源蛋白的表达，降低目标蛋白的胞内降解；减少重组外源蛋白的胞内积累，消除了包涵体的形成；取消了细胞破壁工艺，降低了热原，简化了分离纯化；进而达到降低生产成本，提高蛋白表达和产品质量的目的。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及改造大肠杆菌遗传组基因领域，确切地说是。
技术介绍
近年来，重组蛋白药物市场发展迅猛，已成为一个重要的高新技术产业。其中重要的市场重组蛋白药物主要有人甲状旁腺激素，B淋巴细胞刺激因子，人表皮生长因子，Y 一干扰素，溶血酶素及各种抗体等。在各种重组蛋白的生产中，大肠杆菌仍然是使用最广泛的宿主系统。在大肠杆菌宿主系统中，根据重组蛋白合成后的空间定位，可分为胞内表达与分泌表达。大肠杆菌胞内表达的重组蛋白常形成包涵体，因不正常的空间折叠结构而无活性并沉淀。分泌表达又可分为周质空间表达和胞外表达，而胞外分泌表达的重组蛋白因 其氧化还原环境适宜于形成正常的蛋白空间结构，不形成包涵体，正常情况下为有活性可溶性蛋白，且分泌表达的蛋白很少受到蛋白酶降解。从而提高了活性蛋白的表达水平，降低分离成本。因此，胞外表达对于提高重组蛋白产量和纯度，简化下游工艺具有重要意义。大肠杆菌常缺乏天然的胞外分泌机制，大多数外源蛋白无法分泌到培养基中。胞外渗漏表达是指采用理、化及遗传方法使宿主细胞壁或细胞外膜发生缺失或损伤，从而使目标蛋白渗漏到胞外培养基中。胞外渗漏表达采用的方法可分为化学渗漏，即应用脂溶剂及其它化学试剂控制细胞渗漏；物理渗漏，即应用冻融等物理方法使细胞渗漏；生物渗漏，即应用抗生素等生物试剂使细胞膜或壁的合成受阻而导致渗漏；遗传渗漏，即使用遗传手段改变细胞壁或膜的通透性，使胞内蛋白部分选择性地渗漏至培养基中。遗传渗漏具有多种优势，如可选择性的分泌目标蛋白，无需专门的渗漏工艺，无有毒化学试剂添加等。故遗传渗漏常为目标蛋白渗漏表达的首选。目前报道的大肠杆菌胞外生产重组蛋白的方法常是通过理化诱变筛选遗传突变的胞外高产菌株。但该方法筛选过程复杂，机理不明，重复性差。理论上，遗传工程改造大肠杆菌可导致其细胞外膜或细胞壁缺陷，使其周质空间蛋白部分释放到培养基中。使用遗传工程突变的渗漏菌株进行胞外蛋白的生产鲜有报道。如大肠杆菌的7卻突变体可以将周质空间蛋白渗漏至培养基中而不显著影响菌株的正常生长，但目标蛋白的渗漏比率及其产量仍然有很大的提高空间。此外，共表达裂解蛋白Kil或BRP (细菌素释放蛋白)也能改变大肠杆菌细胞外膜的通透性，从而使周质空间蛋白释放到培养基中。
技术实现思路
本专利技术提供一种大肠杆菌外源蛋白发酵和胞外分泌同时进行的重组蛋白胞外表达的用于重组蛋白分泌型表达的双基因突变大肠杆菌的构建方法，通过遗传工程改造方法得到的细胞壁或膜双基因敲除的通透性增强的分泌型菌株，并将胞内合成的外源蛋白通过信号肽或融合蛋白导入到细胞周质空间，进而选择性地渗漏至培养基中，提高蛋白表达水平并降低分离成本成为本专利技术的目的。，其特征在于使用预先设计的细胞膜蛋白和细胞壁合成酶基因取mrcB，imrcB琳Ipp的双敲除基因或其他基因组合的双敲除基因的引物进行PCR反应，得到两端为10 250 bp特定目标基因同源序列及中间为抗性标记序列的浓度为I 1000 ng/μ 的和arci ,或arci 和Ipp的双敲除基因或其它基因组合的双敲除基因的基因打靶片段，并分别通过电转化整合到宿主大肠杆菌染色体中，得到双基因突变的分泌型大肠杆菌菌株；所述的其他基因组合指的是mrcA, mrdA, rodA, murC, rodZ中任意两个的组合。所述的，其特征在于所述的双基因突变的分泌型大肠杆菌菌株含有的基因/^7和基因编码区发生了突变，或者基因/^7和基因的启动子区域发生了突变，从而使基因和基因《γΜ无法表达出相应Pal和MrcB蛋白产物，或表达出降低了功能的Pal和MrcB蛋白产物，进而正常的细胞膜运输功能发生变化。 所述的，其特征在于 所述的双基因突变大肠杆菌的应用包括外源蛋白表达的分泌型重组大肠杆菌菌株构建、分泌型重组大肠杆菌的目标蛋白表达过程； 所述的外源蛋白表达的分泌型重组大肠杆菌菌株构建方法为将外源目标蛋白质基因先重组到分泌型质粒pET32a(+)中，随后克隆到所述的双基因突变的分泌型大肠杆菌菌株中，进而得到外源蛋白表达的分泌型重组大肠杆菌菌株。所述的，其特征在于所述的外源蛋白表达的分泌型重组大肠杆菌菌株含有编码外源蛋白的重组基因质粒，该重组质粒中外源蛋白基因与定位于周质空间的信号肽编码序列相连，从而使胞内合成的外源蛋白通过信号肽导入于周质空间进而渗漏到培养基中。所述的，其特征在于所述的分泌型重组大肠杆菌的目标蛋白表达过程指的是在发酵培养基中使用外源蛋白表达的分泌型重组大肠杆菌菌株生产外源蛋白。所述的，其特征在于所述的发酵培养基中含有0. I 2%胰蛋白胨，O. 2 10%酵母提取粉，O. 05 5%甘油，O. 02 O. 5% KH2PO4,0. I 2% Κ2ΗΡ04。本专利技术的原理为 本专利技术所说的，主要包括构建特定的细胞膜和细胞壁改变的重组蛋白胞外表达的大肠杆菌生产菌株和在发酵培养基中使用该生产菌株生产外源蛋白。其特征在于使用预先设计的/^7基因和基因敲除引物进行PCR反应，得到两端为10 250 bp特定目标基因同源序列及中间为抗性筛选标记序列的高浓度(10 1000 ng/ml)/7a7基因和《TM基因打靶片段。并将其先后电转化导入到经过诱导的含PKD46的待突变大肠杆菌出发菌株中，从而实现和arc沒的双基因突变。其中所说的细胞膜和细胞壁改变的分泌型重组大肠杆菌生产菌株指'pal和mrcB, M^mrcB和Ipp的双敲除基因及其它基因组合(《rc儿mrdA, rodA, murC, rodZ等)编码区的核苷酸缺失或替换；或在基因的启动子区域的核苷酸缺失或替换的突变菌株。优选pal热mrcB双基因突变。有益效果 I、本专利技术构建的双敲除分泌型菌株提供了一种新的大肠杆菌渗漏发酵重组蛋白途径，目标蛋白的渗漏比率和产量得到了进一步提高。2、本专利技术实现了重组蛋白发酵和胞外分泌同时进行。在发酵过程中，重组目标蛋白可以从胞内渗漏且不显著影响菌体的持续生长，降低了目标蛋白的胞内降解，提高重组蛋白表达；同时减少了重组蛋白的胞内过度积累，而降低了包涵体形成；消除了细胞破壁工艺，减少了热原污染；设计培养基组成，便于分离纯化，进而达到降低了生产成本，提高产品质量的目的。渗漏不仅简化了纯化重组蛋白的工艺，也提高了目标产物的表达水平。经检测，超过50%的重组蛋白渗漏到培养基中，表达水平为10 30%。3、本专利技术采用大肠杆菌的和fflrcS等双基因突变株为宿主和定位外源蛋白于 周质空间的载体，使得外源蛋白的表达和胞外积累同时进行。从而提高重组外源蛋白的表达，降低目标蛋白的胞内降解；减少重组外源蛋白的胞内积累，消除了包涵体的形成；取消了细胞破壁工艺，降低了热原，简化了分离纯化；进而达到降低生产成本，提高蛋白表达和产品质量的目的。经检测，超过50%的外源重组蛋白可渗漏到培养基中，表达水平为10 30%。附图说明图I为双基因敲除突变株目标蛋白表达SDS-PAGE结果(目标蛋白重组硫氧还人甲状旁腺激素融合蛋白；泳道1-7为胞外蛋白，泳道8-14为胞内蛋白，M为标准蛋白)。泳道I为mrcA和/7^7双基因突变株；泳道2为mrcB和/7^7双基因突变株(实施例I);泳道3为Ipp和@7双基因突变株；泳道4为mrcA和Ipp双基因突变株；泳道5为Ipp和mrcB本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种用于重组蛋白分泌型表达的双基因突变大肠杆菌的构建方法，其特征在于：使用预先设计的细胞膜蛋白和细胞壁合成酶基因pal？和mrcB，或mrcB和lpp？的双敲除基因或其他基因组合的双敲除基因的引物进行PCR反应，得到两端为10～250？bp特定目标基因同源序列及中间为抗性标记序列的浓度为1～1000？ng/μl的pal？和mrcB，或mrcB和lpp？的双敲除基因或其它基因组合的双敲除基因的基因打靶片段，并分别通过电转化整合到宿主大肠杆菌染色体中，得到双基因突变的分泌型大肠杆菌菌株；所述的其他基因组合指的是mrcA，mrdA，rodA，murC，rodZ中任意两个的组合。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：童望宇，陈昭元，谢丽，
申请(专利权)人：安徽大学，
类型：发明
国别省市：
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