一种含有HPV16的L1蛋白编码基因的质粒载体及其构建方法技术

本发明专利技术提供了一种含有HPV16的L1蛋白编码基因的质粒载体，其具有SEQ?ID?No.1所示的HPV16的L1蛋白编码基因核苷酸序列。本发明专利技术同时提供了上述载体的构建方法。本发明专利技术质粒载体的成功构建和应用，可以节省HPV16的L1蛋白生产成本及时间，增加产品的安全性。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及基因工程领域，特别是涉及一种含有HPV16的LI蛋白编码基因的质粒载体及其构建方法。
技术介绍
乳头瘤病毒(PV)是一类具有严格宿主范围和组 织特异性的DNA病毒，感染人及动物的皮肤或粘膜上皮细胞。PV主要根据其宿主范围和基因组同源性划分型别。迄今，人乳头瘤病毒(HPV)已分为100多个型。宫颈癌占妇女癌症病死率的第2位，90%宫颈癌的发生与HPV感染有关，其中，HPV16占40-60%。因此，研究和开发HPV16的预防性疫苗，对防止HPV16的感染及由其引起的恶性肿瘤有重要的现实意义。在对乳头瘤病毒(PV)结构和功能的研究中发现，以LI蛋白和L2蛋白为保护性抗原构建的疫苗株很可能在预防HPV感染及其引起的恶性肿瘤方面发挥重要作用。目前国际上常通过原核和真核表达系统获得LI和L2蛋白，多用大肠杆菌、酵母等生产HPV16的LI蛋白。由于大肠杆菌等缺乏蛋白质折叠过程中需要的某些酶和辅助因子，导致中间体大量积聚，容易形成包涵体沉淀、不可溶、无生物活性等。
技术实现思路
为解决目前大肠杆菌、酵母等生产HPV16的LI蛋白所存在的沉淀问题，本专利技术的目的在于提供一种含有HPV16的LI蛋白编码基因的质粒载体及其构建方法。本专利技术提供的一种含有HPV16的LI蛋白编码基因的质粒载体，具有SEQ ID No. I所示的HPV16的LI蛋白编码基因核苷酸序列。所述HPV16的LI蛋白编码基因的3'端有终止子和Hind III酶切位点，5'端紧密链接HBM (Honey bee Melittin)分泌信号肽序列，其Y端有BamH I酶切位点；所述含有HPV16的LI蛋白编码基因的质粒载体，含有SEQ IDNo. 2所示的核苷酸序列。所述含有HPV16的LI蛋白编码基因的质粒载体，其出发载体可为pFastBac I(Invitrogen 公司)、pFastBac HTA (Invitrogen 公司)、pFastBac HTB (Invitrogen 公司)、pFastBac HTC (Invitrogen 公司)、pFastBac Dual (Invitrogen 公司)，其中，优选pFastBacl载体(Invitrogen公司)，以pFastBacl载体为出发载体构建的含有HPV16的LI蛋白编码基因的质粒载体为pFastBacl-HPV16Ll。上述重组表达载体均可按照常规方法构建。所述含有HPV16的LI蛋白编码基因的质粒载体pFastBacl_HPV16Ll的抗性基因为庆大霉素(Gentamicin)抗性基因和氨节青霉素(Ampicillin)抗性基因。本专利技术还提供上述含有HPV16的LI蛋白编码基因的质粒载体的构建方法，包括如下步骤a、人工合成SEQ ID No. 2所示的核苷酸序列，并克隆于pGH载体，命名为PGH-B2188G ；b、BamH I和Hind III酶切消化pGH_B2188G和pFastBacl，胶回收试剂盒分别回收1668bp目的片段及4665bp载体片段，按照4:1比例，16°C连接15小时，氯化钙法转化大肠杆菌DH5 α，涂布于含有100 μ g/ml氨苄青霉素的LB琼脂平板，筛选阳性克隆，提取质粒，得到含有HPV16的LI蛋白编码基因的质粒载体。本专利技术还提供所述含有HPV16的LI蛋白编码基因的质粒载体在重组蛋白质生产中的应用。 本专利技术还提供所述含有HPV16的LI蛋白编码基因的质粒载体在疫苗生产中的应用。本专利技术的有益效果在于本专利技术质粒载体的成功构建和应用，可以节省HPV16的LI蛋白生产成本及时间,增加产品的安全性。(I)以分泌表达型载体生产的重组蛋白产品活性高。分泌表达载体生产的蛋白可以进行一系列的翻译后加工，产品接近天然提取物，活性高，不易产生抗药性。(2)避免酵母大肠杆菌等生产HPV产生沉淀问题。(3)产品易于纯化。由于分泌蛋白，不涉及破碎细胞，直接从培养细胞的培养基内纯化蛋白，省略破碎细胞环节，没有从破碎后大量无关蛋白中分离目的蛋白而烦恼。(4)生产成本降低。由于产品纯化环节简化，既节省了纯化时间，又减少很多无关设备的投入。附图说明图I为本专利技术载体pFastBacl_HPV16Ll构建的技术路线图。图2为本专利技术pGH-B2188G质粒图。图3 为本专利技术 pGH-B2188G 和 pFastBac IHind III/BamH I 双酶切电泳图。图4 为本专利技术 pFastBac 1-HPV16L1 质粒图。图5为本专利技术pFast Bacl_HPV16LlHind III单酶切验证电泳图。图6为本专利技术pFast Bacl_HPV16LlHind III/BamH I双酶切验证电泳图。图7为本专利技术pFast Bacl_HPV16LlBgl II /Xho I双酶切验证电泳图。具体实施例方式以下实施例用于说明本专利技术，但不用来限制本专利技术的范围。试剂及器材感受态细菌E. coli DH5a购自天根生化科技(北京)有限公司。内切酶BamH I、Hind III、Bgl II、Xho I购自TAKARA公司，T4DNA连接酶购自NEB公司，胶回收试剂盒购自QIAGEN公司，其余试剂为国产分析纯，核酸电泳仪购自美国伯乐(Bio-Rad)公司，水浴锅购自精科华瑞公司。实施例I人工合成pGH-B2188G按照图I所不的技术路线图构建本专利技术所述含有HPV16的LI蛋白编码基因的质粒载体 pFastBac 1-HPV16L1。查阅国内外有关HPV16L1资料，利用优化序列软件对报道的HPV16L1基因序列进行优化，在HPV16L1序列Y端加上酶切位点及HBM(Honey bee Melittin)分泌信号肽序列，3'端加上终止子及酶切位点，软件构建完成SEQ ID No. 2所示的核苷酸序列，送(请补充具体公司名)合成公司人工合成并克隆于PGH载体，命名为pGH-B2188G，其结构如图2所/Jn ο实施例2双酶切pGH-B2188G回收1668bp片段将合成的质粒pGH-B2188G使用内切酶BamH I和Hind III进行双酶切，反应体系质粒 PGH-B2188G20μ1BamH IΙμ Hind IUΙμ I OxBuffer H5μ1IOxBSA5μ1 消毒去离子水18μ1 反应总体积50μ1以上成分混匀，37°C水浴3小时，取少量样品经O. 8%琼脂糖凝胶电泳鉴定，电泳结果参见图3的电泳泳道2，显示已经完全切开得到1668bp的片段。将剩余样品进行O. 8%琼脂糖凝胶电泳，使用凝胶回收试剂盒回收1668bp目的片段。实施例3双酶切pFastBacl回收4665bp片段将质粒pFastBacl使用内切酶BamH I和Hind III进行双酶切，反应体系.质粒 pFastBacl20μIBamH IΙμ Hind IIIΙμ IOxBufferH5μ1IOxBSA5μ1 消毒去离子水18μ1 反应总体积50μ1以上成分混匀，37°C水浴3h，取少量样品经O. 8%琼脂糖凝胶电泳鉴定，电泳结果参见图3的电泳泳道1，显示已经完全切开，得到4665bp的片段。将剩余样品进行O. 8%琼脂糖凝胶电泳，使用凝胶回收试剂盒回收4665bp目的片段。 实施例4连接片段16本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种含有HPV16的L1蛋白编码基因的质粒载体，具有SEQID？No.1所示的HPV16的L1蛋白编码基因核苷酸序列。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：林福玉，郭家明，智静娟，魏文进，
申请(专利权)人：北京民海生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：