【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及生物制品，尤其涉及一种制备肺炎链球菌荚膜多糖或其降解多糖的方法。
技术介绍
1、肺炎链球菌感染是在全球范围内引起死亡的重要原因之一，也是肺炎、脑膜炎、中耳炎的主要病因。随着抗菌素的大量使用，耐药菌株与日俱增，疫苗的研发备受关注。研究中发现细菌表面的荚膜多糖能够保护机体对抗细菌感染，由于多糖是非胸腺依赖性抗原，再次免疫不能使降低的抗体达到初次免疫的水平，不能诱导免疫记忆细胞的产生，且对婴幼儿和老人几乎没有保护作用，而该年龄段人群是肺炎链球菌感染的高危人群。而将肺炎链球菌荚膜多糖偶联到蛋白载体上，使其成为胸腺依赖性抗原，能够在t细胞和巨噬细胞的辅助下激活b细胞产生抗体，对婴幼儿提供免疫保护，诱导免疫记忆，再次免疫具有加强免疫效应。研究显示，肺炎链球菌疫苗的引入显著降低了全球肺炎链球菌疾病的负担。
2、肺炎链球菌荚膜多糖是由重复单元构成的一系列分子量不等的高分子同系物，通常通过将肺炎链球菌发酵培养并从发酵培养物中提取纯化得到。一方面，制备肺炎链球菌荚膜多糖疫苗时，存在多糖纯化工艺较为复杂，纯化周期长，使用试剂存在安全或健康风险等问题，例如：现有的肺炎链球菌精制多糖制备方法中往往采用苯酚、乙醇等有机试剂，危害人体健康且完全去除较难；在制备肺炎链球菌精制多糖时往往工艺复杂，耗时较长；另外，在制备精制多糖时经常会使用层析系统（例如：中国专利申请cn104815327a、cn108079286a、cn112646050a、cn116970095a等），仪器和材料昂贵，大大增加了生产成本。中国专利申请cn1169700
3、另一方面，在制备肺炎链球菌荚膜多糖结合疫苗时，多糖往往分子量较大，而分子量过大不利于多糖的结合，分子量过小会影响免疫原性，因此需要通过一定的方法将多糖大分子降解成小分子量的多糖，以满足肺炎链球菌结合疫苗的需求和应用。现有的荚膜多糖降解工艺是将肺炎链球菌精制多糖冻干制剂溶解后再进行降解，操作复杂，不适于大规模生产应用。
技术实现思路
1、本专利技术提供制备一种制备肺炎链球菌荚膜多糖或其降解多糖的方法。
2、本专利技术在肺炎链球菌荚膜多糖制备方法的研发过程中，偶然发现了一种简单、快速的肺炎链球菌多糖制备方法，该方法只需利用钙盐在酸性条件下进行一步沉淀（一步钙盐酸沉）配合常规超滤步骤，即可制备高质量的精制多糖，且制得精制多糖的各项指标均高于中国药典标准，显著降低了物料和时间成本，提高了纯化效率。
3、具体地，本专利技术提供以下技术方案：
4、本专利技术提供一种制备肺炎链球菌荚膜多糖或其降解多糖的方法，所述方法包括：将肺炎链球菌的发酵培养物进行杀菌处理后，分离上清液，将所述上清液依次进行第一超滤处理、沉淀处理和第二超滤处理；
5、或者，将所述上清液依次进行第一超滤处理、沉淀处理、降解处理和第二超滤处理；
6、其中，所述沉淀处理使用的沉淀剂包含钙盐，所述沉淀处理为在ph 2.4-3.6条件下进行。
7、本专利技术的制备方法分为不进行降解处理和进行降解处理两种实施方式，不进行降解处理的方法制得的荚膜多糖（精制多糖）分子量相对较大，适用于制备肺炎链球菌荚膜多糖疫苗，经降解处理可得到分子量降低的多糖（降解多糖），更适用于与载体蛋白（如tt、dt、crm197等）结合后用于制备肺炎链球菌荚膜多糖结合疫苗。
8、本专利技术发现，在上述“一步钙盐酸沉”方法的基础上，可将降解处理设置在“一步钙盐酸沉”之后，而无需将制得的冻干精制多糖重新溶解后再进行降解处理，极大地简化了工艺流程，提高了制备效率。
9、以钙盐作为沉淀剂并在ph 2.4-3.6的酸性条件下进行沉淀处理（钙盐酸沉）是上述制备方法得以实现其效果的关键。配合于上述“钙盐酸沉”，在其前后分别设置一次超滤处理，第一超滤处理的主要作用在于去除发酵培养物杀菌处理后的上清液中的小分子杂质，进而更有利于“钙盐酸沉”更好地发挥除杂作用，提高杂质的去除效率，第二超滤处理的主要作用在于浓缩多糖溶液以及对多糖溶液进行洗滤，进一步除去多糖溶液中的小分子杂质以及盐离子。
10、优选地，所述钙盐为氯化钙。
11、优选地，所述钙盐在沉淀体系中的终浓度为80-200 mmol/l。
12、优选地，在第一超滤处理得到的第一超滤浓缩液添加终浓度为80-200 mmol/l的氯化钙，采用酸液将ph调至2.4-3.6，进行沉淀处理。
13、优选地，所述沉淀处理为在2-8℃处理1-5h后收集上清液，得到第一上清液。
14、与一些已有肺炎链球菌荚膜多糖的纯化方法需要升温酸沉（升温酸沉容易导致多糖的降解，造成分子量下降，影响其免疫原性）不同，本专利技术的沉淀处理只需在低温条件下进行即可实现较好的除杂效果。
15、对于包含降解处理步骤的实施方式，所述降解处理为采用化学处理法或物理处理法进行。
16、其中，所述化学处理法优选为采用三氟乙酸进行降解处理，得到降解处理物。
17、所述物理处理法优选为采用超声波处理法或高压均质处理法进行降解处理，得到降解处理物。
18、具体地，超声波处理法可参见中国专利cn108079286b，高压均质处理法可参见中国专利申请cn106413747a。
19、在本专利技术的一些实施方式中，采用三氟乙酸进行降解处理，其中，三氟乙酸的终浓度为0.2-2mol/l。优选所述降解处理为在25-60℃处理2-10h。在降解处理结束后，收集上清液。
20、上述降解处理将大分子多糖降解为适合用于结合疫苗制备且不影响其免疫原性的适合分子量的降解多糖。
21、以上所述的方法还包括：将沉淀处理得到的第一上清液或所述降解处理物的ph调至6.8-7.5后，收集上清液，得到第二上清液，将所述第二上清液进行第二超滤处理。
22、本专利技术中，将ph调至酸性可采用酸液进行，包括但不限于冰醋酸、盐酸、磷酸等；优选为磷酸。将ph调至中性或碱性可采用碱液进行，包括但不限于氢氧化钠、氢氧化钾等；优选为氢氧化钠。
23、以上所述的方法中，所述第一超滤处理使用孔径为100-150kd（优选为100kd）的超滤膜进行。
24、在本专利技术的一些实施方式中，所述第一超滤处理为使用孔径为100kd的膜包浓缩3-5倍后等体积超滤。优选地，超滤所用纯化水体积为浓缩液体积的4-6倍。
25、以上所述的方法中，对于未经降解处理制得的第二上清液，所述第二超滤处理使用孔径本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种制备肺炎链球菌荚膜多糖或其降解多糖的方法，其特征在于，所述方法包括：将肺炎链球菌的发酵培养物进行杀菌处理后，分离上清液，将所述上清液依次进行第一超滤处理、沉淀处理和第二超滤处理；
2.根据权利要求1所述的制备肺炎链球菌荚膜多糖或其降解多糖的方法，其特征在于，所述钙盐为氯化钙；
3.根据权利要求2所述的制备肺炎链球菌荚膜多糖或其降解多糖的方法，其特征在于，所述沉淀处理为在2-8℃处理1-5小时后收集上清液，得到第一上清液。
4.根据权利要求1~3任一项所述的制备肺炎链球菌荚膜多糖或其降解多糖的方法，其特征在于，所述降解处理为采用化学处理法或物理处理法进行。
5.根据权利要求4所述的制备肺炎链球菌荚膜多糖或其降解多糖的方法，其特征在于，所述化学处理法为采用三氟乙酸进行降解处理，得到降解处理物；
6.根据权利要求5所述的制备肺炎链球菌荚膜多糖或其降解多糖的方法，其特征在于，采用三氟乙酸进行降解处理中，三氟乙酸的终浓度为0.2-2mol/L，和/或，所述降解处理为在25-60℃处理2-10h。
7.根据权利要
8.根据权利要求1~3、5、6任一项所述的制备肺炎链球菌荚膜多糖或其降解多糖的方法，其特征在于，所述第一超滤处理使用孔径为100-150KD的超滤膜进行；
9.权利要求1~8任一项所述的制备肺炎链球菌荚膜多糖或其降解多糖的方法制备得到的肺炎链球菌荚膜多糖或其降解多糖。
10.权利要求1~8任一项所述的制备肺炎链球菌荚膜多糖或其降解多糖的方法或权利要求9所述的肺炎链球菌荚膜多糖或其降解多糖在制备含肺炎链球菌荚膜多糖产品中的应用。
11.一种肺炎链球菌荚膜多糖疫苗或肺炎链球菌荚膜多糖结合疫苗，其特征在于，所述疫苗包含权利要求9所述的肺炎链球菌荚膜多糖或其降解多糖。
12.一种肺炎链球菌荚膜多糖疫苗或肺炎链球菌荚膜多糖结合疫苗的制备方法，其特征在于，所述方法包括：利用权利要求1~8任一项所述的制备肺炎链球菌荚膜多糖或其降解多糖的方法制备得到肺炎链球菌荚膜多糖或其降解多糖，以所述肺炎链球菌荚膜多糖或其降解多糖为免疫原制备肺炎链球菌荚膜多糖疫苗或肺炎链球菌荚膜多糖结合疫苗。
...【技术特征摘要】
1.一种制备肺炎链球菌荚膜多糖或其降解多糖的方法，其特征在于，所述方法包括：将肺炎链球菌的发酵培养物进行杀菌处理后，分离上清液，将所述上清液依次进行第一超滤处理、沉淀处理和第二超滤处理；
2.根据权利要求1所述的制备肺炎链球菌荚膜多糖或其降解多糖的方法，其特征在于，所述钙盐为氯化钙；
3.根据权利要求2所述的制备肺炎链球菌荚膜多糖或其降解多糖的方法，其特征在于，所述沉淀处理为在2-8℃处理1-5小时后收集上清液，得到第一上清液。
4.根据权利要求1~3任一项所述的制备肺炎链球菌荚膜多糖或其降解多糖的方法，其特征在于，所述降解处理为采用化学处理法或物理处理法进行。
5.根据权利要求4所述的制备肺炎链球菌荚膜多糖或其降解多糖的方法，其特征在于，所述化学处理法为采用三氟乙酸进行降解处理，得到降解处理物；
6.根据权利要求5所述的制备肺炎链球菌荚膜多糖或其降解多糖的方法，其特征在于，采用三氟乙酸进行降解处理中，三氟乙酸的终浓度为0.2-2mol/l，和/或，所述降解处理为在25-60℃处理2-10h。
7.根据权利要求1~3、5、6任一项所述的制备肺炎链球菌荚膜多糖或其降解多糖的方法，其特征在于，所述方...
【专利技术属性】
技术研发人员：刘艳丽，高志鑫，李跃龙，曹欣，王剑龙，刘建凯，郑海发，
申请(专利权)人：北京民海生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：
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