拆分荧光蛋白的融合蛋白的组合及其表达载体和应用制造技术

一种拆分荧光蛋白的融合蛋白的组合和其表达载体，以及在细胞融合时通过检测该拆分荧光蛋白的融合蛋白的组合中自我重新结合后的荧光蛋白的萤光来筛选病毒包膜蛋白的受体的方法，和筛选膜融合的促进剂或抑制剂的方法。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及一种拆分荧光蛋白的融合蛋白的组合及其表达载体，以及通过该拆分荧光蛋白的融合蛋白的组合筛选病毒包膜蛋白的受体的方法，和筛选膜融合的促进剂或抑 制剂的方法。特别是可以通过显示在细胞膜上的萤光来筛选病毒包膜蛋白的受体的方法， 以及，筛选膜融合的促进剂或抑制剂的方法。
技术介绍
膜融合是生物系统中非常普遍的现象。肌肉发生，受精作用，以及囊泡的运输过程 中都涉及到膜融合。具有包膜的病毒侵染宿主细胞，同样依赖于膜融合。膜融合是由两个 膜所分开的两个独立区室发生合并形成一个区室的过程。人们可以使用多种不同的技术监 测这个过程。 一种方法是使用一对拆分蛋白，当它们相互重新结合的时候，将会重新获得其 整体蛋白的活性。 膜融合是有包膜病毒(其中一些与新发传染病相关，例如禽流感，SARS以及艾滋 病)侵入宿主细胞时首先要发生的步骤。在这些新发传染病中，HIV-1的感染以及AIDS已 对人类的健康形成了全球性的威胁。在结构导向的融合抑制剂获得成功之后，HIV-1包膜 蛋白(Env)成为了一个重要的抗HIV-1化疗耙点(Chan，1997 ;Weissenhorn， 1997 ;Eckert，2001 ;Este，2007 ;Poveda， 2005)。最近，研究人员设计出了一种旨在干扰Env与其辅助受体 CCR5相互作用的新型抑制剂(Santoro，2004)。因此，Env介导的膜融合的表型鉴定方法对 于新抑制剂的研发或者药物抗性突变株的评估是非常有价值的(01son，2003)。 对于HIV-1，研究人员利用细胞-细胞或者病毒_细胞的膜融合分析方法已经设 计出了一些能产生可测量或者可辨别信号的表型鉴定方法。其中，观察合胞体的形成是最 简单的方法(Kimpton， 1992);但这种方法不能保证客观且定量。利用在膜融合过程中，从 一个区室到另一个区室发生的物质转移所释放出的信号，如可视染料，转录因子，自我互补 的蛋白质片断，是分析膜融合的主要方法手段(Lin，2005 ;Sakamoto，2003 ;Bl咖enthal，2002 ;Barbeau， 1998 ;Furuta， 2006)。使用这类方法，通过光学设备的监测，如激光共聚 焦显微镜，加载到膜上或者胞质中的染料的移动能提供膜融合的详细信息(Blumenthal， 2002)。还可以通过流式细胞技术(FACS)完成高通量的分析(Huerta，2002 ;Lin，2003)。 但前者并不能处理太多的样品，而后者需要进一步优化将细胞聚集现象和真正 的融合现象区分出来(Huerta，2006)。研究人员也广泛地使用转录因子实现对膜融合的 检测，例如使用T7RNA聚合酶(T7RNApo1)或者Tat，与他们所识别的启动子驱动的报告基 因(Feng， 1996 ;Lin，2005 ;Sakamoto, 2003 ;Barbeau， 1998)。此方法既敏感而且可以定量， 但是由于报告基因存在转录和翻译的过程，因而具有一段延迟时间。同时，那些具有自我 互补能力的蛋白片断，特别是拆分的酶，由于具有通用性也被研究人员经常用到；但由于 大部分的酶底物不具有膜通透性，这样的分析方法通常需要破坏细胞膜(Holland, 2004 ; J皿，2007)。这样就不能够对膜融合事件进行连续地监测。也有人使用电生理记录的方法 (Monck， 1992)，但是这种方法使用并不广泛，因为其方法建立非常复杂并且能够同时分析的事件数目太少。 所以在现有技术里就不存在一种技术，即为对大量样品既迅速又准确地鉴定Env 介导的膜融合的表型的方法。同时也缺乏一种简便地筛选病毒包膜蛋白的受体的方法，和 一种简便地筛选膜融合的促进剂或抑制剂的方法。
技术实现思路
( — )专利技术的摘要 (专利技术所要解决的问题) 本专利技术经过对大量拆分蛋白的研究和实验，发现利用基因工程改造的拆分绿色荧 光蛋白(GFP)开发了一种基于细胞的通用膜融合检测方法。这种方法可以解决前述问题， 即迅速又准确地鉴定Env介导的膜融合的表型的方法。同时也提供一种简便地筛选病毒包 膜蛋白的受体的方法，和一种简便地筛选膜融合的促进剂或抑制剂的方法。 [OOW] (二)专利技术的详细说明 本专利技术的目的是提供一种拆分荧光蛋白的融合蛋白的组合，包括第一拆分 荧光蛋白的融合蛋白和第二拆分荧光蛋白的融合蛋白，其中，第一拆分荧光蛋白的 融合蛋白，为可自我重新结合的已被拆分的荧光蛋白的一部分和一种和磷脂酰肌醇 (phosphatidylinositol)结合的蛋白的融合蛋白；第二拆分荧光蛋白的融合蛋白，为前述 荧光蛋白的剩余部分和前述的磷脂酰肌醇(phosphatidylinositol)结合的蛋白的融合蛋 白，其特征在于，前述的第一拆分荧光蛋白的融合蛋白与前述第二拆分荧光蛋白的融合蛋 白结合后，前述荧光蛋白可以自我重新结合恢复拆分前的荧光功能，从而发出荧光。 本专利技术的另外一个目的是提供一种病毒包膜蛋白的受体的筛选方法，该方法包括 以下步骤a)将本专利技术(权利要求5)所述的包膜蛋白表达载体转入第一细胞中表达，b)将 本专利技术(权利要求5)所述的另外一个不含有包膜蛋白的基因的表达载体转入第二细胞中 表达，该第二细胞同时含有该包膜蛋白所对应的受体，c)混合第一细胞和第二细胞，d)检 验第一细胞和第二细胞通过病毒包膜蛋白与受体结合的方式融合后的荧光，该萤光为前述 第一荧光蛋白和前述第二荧光蛋白中的至少一个自我重新结合后恢复的拆分前的萤光。 本专利技术的另外一个目的是提供一种膜融合的促进剂或抑制剂的筛选方法，该方法 包括以下步骤a)将本专利技术(权利要求5)所述的包膜蛋白表达载体转入第一细胞中表达， b)将本专利技术(权利要求5)所述的另外一个不含有包膜蛋白的基因的表达载体转入第二细 胞中表达，该第二细胞同时含有该包膜蛋白所对应的受体，c)加入促进或抑制病毒包膜蛋 白与受体结合的促进剂或抑制剂，d)混合第一细胞和第二细胞，e)检验第一细胞和第二细 胞通过病毒包膜蛋白与受体结合的方式而融合后的荧光，该萤光为前述第一荧光蛋白和前 述第二荧光蛋白中的至少一个自我重新结合后恢复的拆分前的萤光。 本专利技术是利用基因工程改造的拆分绿色荧光蛋白(GFP)开发了一种基于细胞的 通用膜融合检测方法。其原理在于这种拆分GFP蛋白在膜融合的时候会发生重新结合，进 而能够发出荧光。本专利技术将为膜周边蛋白(PMP :peripheralmembrane protein)融合到拆 分GFP蛋白的N末端就可以进一步将这个检测信号定位到膜上。 如果将膜周边蛋白的一种ra结构域(pleckstrin homology domain)融合到拆分 GFP蛋白的N末端就可以进一步将这个检测信号定位到膜上。当使用该方法检测HIV-lEnv5介导的膜融合过程的时候，在共培养的30分钟后即可检测到绿色荧光信号。使用该方法不加入任何其它外源性底物即可进行活体细胞监测。(具体实施形态) 以下通过提供本专利技术的具体实施形态来说明本专利技术，但是这里说明的具体实施形 态只是本专利技术的一个实施例而已，不是用来限定本专利技术的范围以及其等同范围的。属于本
的技术者可以容易地理解本说明书所记述的专利技术范围以及本专利技术的等同范围。 (第一实施形本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种拆分荧光蛋白的融合蛋白的组合，包括第一拆分荧光蛋白的融合蛋白和第二拆分荧光蛋白的融合蛋白，其中，第一拆分荧光蛋白的融合蛋白，为可自我重新结合的已被拆分的荧光蛋白的一部分和一种和磷脂酰肌醇（ｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｙｌｉｎｏｓｉｔｏｌ）结合的蛋白的融合蛋白；第二拆分荧光蛋白的融合蛋白，为前述荧光蛋白的剩余部分和前述的磷脂酰肌醇（ｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｙｌｉｎｏｓｉｔｏｌ）结合的蛋白的融合蛋白，　　其特征在于，前述的第一拆分荧光蛋白的融合蛋白与前述第二拆分荧光蛋白的融合蛋白结合后，前述荧光蛋白可以自我重新结合恢复拆分前的荧光功能，从而发出荧光。

【技术特征摘要】
一种拆分荧光蛋白的融合蛋白的组合，包括第一拆分荧光蛋白的融合蛋白和第二拆分荧光蛋白的融合蛋白，其中，第一拆分荧光蛋白的融合蛋白，为可自我重新结合的已被拆分的荧光蛋白的一部分和一种和磷脂酰肌醇(phosphatidylinositol)结合的蛋白的融合蛋白；第二拆分荧光蛋白的融合蛋白，为前述荧光蛋白的剩余部分和前述的磷脂酰肌醇(phosphatidylinositol)结合的蛋白的融合蛋白，其特征在于，前述的第一拆分荧光蛋白的融合蛋白与前述第二拆分荧光蛋白的融合蛋白结合后，前述荧光蛋白可以自我重新结合恢复拆分前的荧光功能，从而发出荧光。2. 根据权利要求l所述的一种拆分荧光蛋白的融合蛋白的组合，其中，前述一种和 磷脂酰肌醇(phosphat idylinositol)结合的蛋白是PH结构域(pleckstrin homology domain)。3. 根据权利要求1所述的一种拆分荧光蛋白的融合蛋白的组合，其中，前述第一荧光 蛋白和前述第二荧光蛋白中的至少一个，是绿色荧光蛋白，其拆分点在氨基酸序列的第214 和第215之间。4. 一种表达载体的组合，包括第一表达载体和第二表达载体，其特征在于，第一表达载 体包括表达前述第一拆分荧光蛋白的融合蛋白的基因，第二表达载体包括表达前述第二拆 分荧光蛋白的融合蛋白的基因。5. 根据权利要求4所述的一种表达载体的组合，其中，前述第一表达载体和前述第二 表达载体中的任一个为包膜蛋白表达载体，再包括了表达病毒包膜蛋白的基因，该包膜蛋 白表达载体可以同时表达包膜蛋白以及第一拆分荧光蛋白的融合蛋白或第二拆分荧光蛋 白的融合...

【专利技术属性】
技术研发人员：松田善卫，近藤直幸，岩本爱吉，王健琪，
申请(专利权)人：国立大学法人东京大学，中国科学院生物物理研究所，
类型：发明
国别省市：JP[日本]