本发明专利技术提供了一种抗虫蛋白Cry1A.401，其特征在于，其具有：1)由SEQ?ID?No.2所示的氨基酸序列；或2)SEQ?ID?No.2所示的氨基酸序列经取代、缺失和/或增加一个或多个氨基酸且具有同等功能的氨基酸序列。体外实验证明改造合成的Bt基因产毒蛋白对玉米螟有显著的杀虫效果，本发明专利技术的抗虫基因Cry1A.401能够在单子叶植物中稳定高效表达，进而用于生产抗虫转基因植物。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及基因工程和生物防治领域，具体地说，涉及一种抗虫蛋白CrylA. 401、 其表达载体及应用。
技术介绍
Bt基因编码杀虫晶体蛋白，来自苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringHansis)。它在芽孢形成过程中产生S-内毒素的杀虫伴胞晶体蛋白，这些蛋白具有很高的杀虫活性。 一般认为，晶体蛋白的杀虫作用分为5个步骤包括溶解、酶解活化、与受体结合、插入、孔洞或离子通道形成，每个步骤都能够影响晶体蛋白的杀虫效果(Moonsom等，2007)。伴胞晶体进入昆虫机体后，在中肠的碱性条件下二硫键被打开，溶解为前毒素，然后在胰蛋白酶的作用下激活成有活性的毒素蛋白。然后毒素蛋白与中肠上皮细胞膜受体结合，有毒性的 α-螺旋穿透细胞质膜形成孔或灶，破坏细胞膜表面的膜电势，细胞渗透性平衡失调，胀破裂解，中肠坏死，围食膜和中肠上皮受损，中肠内的碱性物质进入血腔，导致昆虫麻痹死亡 (Soberon等,2009)。在过去的几十年里，已确定数十种苏云金芽孢杆菌菌系及130多种它们编码的杀虫晶体蛋白。1986年，首批转基因植物(抗虫、抗除草剂)被批准进入田间试验。1987年，比利时Vaeck等人首次获得转Bt杀虫蛋白的抗虫烟草，但只能检测到微弱的抗虫性，其表达蛋白几乎检测不到，只占可溶性蛋白的O. 001%。同年又有两次获得Bt转基因植株的报道 (Barton等，1987 ；Fischhoff等，1987)。1989年哺乳动物抗体重链和轻链基因在烟草中成功表达并正确组装成有功能的抗体。到1990年，至少有7个研究小组获得Bt转基因植物并应用于大田试验(Estruch J等，1996)。1993年,Michael等人对CrylAb基因进行改造, 获得Bt转基因植株，对玉米螟有很好的抗性。KozHal (1993)等人工合成了一个G+C含量达到65%的结构基因(与野生型CryIA (b)基因的同源性为65 %)，利用基因枪技术把该合成基因导入玉米品种，培育出了抗虫转基因玉米，转基因植株能高水平表达CrylA (b)抗虫基因。1996年，Joachim W等人将CrylAb进行截短修饰，转化水稻，获得转Bt水稻，靶标害虫死亡率达100%。1998年，Cheng等人根据植物所偏爱的密码子，改造了 CrylAb和 CrylAc基因用农杆菌转化法转化水稻获得转基因植株，R2代虫试，5天内有100%致死率。 Bohotova等(2001)人工改造合成CrylB基因,转化热带玉米得到转基因玉米能有效防治玉米螟。我国对Bt杀虫蛋白基因的研究主要是1992年，郭三堆等人采用植物优化密码子方法首先在国内人工合成全长1824bp的GFMCrylA杀虫基因，获得了中国第一代单价抗虫棉。丁群星等(1993)和王国英等(1995)分别用子房注射法和基因枪法将pB48. 415质粒转入玉米愈伤组织中获得转基因植株，抗虫性测定表明其具有一定抗虫性。李慧芬等(2002) 用基因枪转化技术将CrylAc3-cpti融合基因导入玉米优良自交系E28及340的胚性愈伤组织中，获得可育的转基因植株，且部分转基因玉米植株对玉米螟虫有较强的抗性。朱常香(2003)通过共转化法将含有CrylAb基因和bar基因的两个质粒导入玉米自交系，2个基因共整合的频率为70%，且呈连锁遗传和表达，大部分转化植株具有较高的抗虫性。张红伟等(2004)利用基因枪法将Bt基因GFMCrylA导入玉米杂交种‘京玉7号’(501/京24)的亲本之一一自交系501的幼胚和愈伤组织中，从转基因高世代材料中筛选出高抗玉米螟的转基因株系T123，并配制出高抗玉米螟杂交新组合。共转化法能够实现多基因在同一受体植株中转化，被引入应用到转Bt毒蛋白基因玉米的研究中，取得了一定的成果。张艳贞等(2004)采用农杆菌介导法将Bt基因导入玉米自交系340、4112中，经PCR、PCR-Southern 和Southern blotting检测，证明外源基因Bt已稳定整合到玉米基因组中，平均转化率为 2.35%。李余良等(2007)利用基因枪法将Bt和GNA基因共转化超甜玉米自交系SI幼胚， 获得含Bt基因11株，其中有5株能扩增出GNA基因。对9株转基因Tl代植株叶片室内接虫抗性鉴定，有5株转基因植株表现较强的抗性。袁英等(2007)采用基因枪法将杀虫毒蛋白基因(CrylA)导入东北春玉米自交系铁7922中，通过对后代植株的PPT筛选、分子鉴定和ELISA法检测，证明外源基因已经整合到玉米基因组中并可以稳定遗传，且筛选出一批抗玉米螟自交系。近年来，研究表明从分子水平上对Bt基因序列进行改造和对相关调控元件进行优化能够提高基因的表达量，得到了越来越多研究者的关注。Wang等(2008)将一个由ubi启动驱动的CrylAh基因转入玉米幼胚,结果表明阳性转化植株对亚洲玉米螟具有较高抗性，并且通过对比试验证明ubi启动子能够有效提高Bt毒蛋白的表达量。我国在转基因技术研究方面，已经建立了比较成熟的玉米转基因技术体系。转基因作物中应用最多的是第一大类中的Cry IAb，其次是Cry I Ac和Cry IF。 CrylAb蛋白是一类由苏云金芽孢杆菌产生的对鳞翅目害虫具有毒杀作用的伴胞晶体，其在生物防治领域具有重要的应用前景。苏云金杆菌S-内毒素基因CrylAb来源于微生物，但其转基因植物存在表达量低、表达产物不稳定、抗虫性效果差等问题。通过改造碱基序列提高GC含量能提高其在转基因植物中的表达量，达到杀虫目的(Koziel，1993)。CrylAc杀虫晶体蛋白，一般由1100-1200个氨基酸组成，分子量在130-140kD之间。就交互抗性而言， 研究表明能够在表达CrylF蛋白的转基因玉米TC1507上完成幼虫发育的CrylF抗性欧洲玉米螟品系，与CrylAb和Cry9C没有交互抗性,仅对CrylAc有低水平的交互抗性(Pereira E J G，2008)。一般认为结构域I参与孔道的形成，结构域II决定毒素与受体的特异性结合，结构域III主要调节毒素的活性。玉米是重要的粮食作物，又是重要的饲料和工业原料，当前玉米虫害(以玉米螟为主)严重，造成玉米大量减产，因此采取有效措施控制其危害对提高玉米产量、增加农民收入具有重要的意义。由于缺乏合适的抗虫品种，目前解决虫害的主要方法是在生长过程中喷施化学杀虫剂；但是化学杀虫剂同时杀死害虫及其天敌，造成生态不平衡和环境污染。 通过转基因技术，可以将抗虫基因导入玉米品种中，进而提高转基因玉米的抗虫性，降低农药的使用量，节省人力、物力及社会资源。因此，应用新的抗虫基因、提高杀虫蛋白的表达量以及培育新型抗虫转基因玉米是解决上述问题的最有效途径之一。
技术实现思路
为了解决上述问题，本专利技术的目的在于提供一种抗虫蛋白CrylA. 401。本专利技术的另一个目的是提供编码上述蛋白的基因。本专利技术的另一个目的是提供含有上述基因的载体。本专利技术的另一个目的是提供上述载体的宿主细胞。本专利技术的另一个目的是提供上述蛋白在提高转基因植物抗虫性中的应用。本专利技术的进一步目的是提供上述蛋白在制备杀虫剂中的应用。为了实现本专利技术目的，本专利技术提供的一种抗虫蛋白CrylA. 401，其具有1)由SEQ ID No.本文档来自技高网...
【技术保护点】
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：翁建峰，李新海，杨小艳，李明顺，郝转芳，张德贵，白丽，张芳军，雷开荣，张世煌，
申请(专利权)人：中国农业科学院作物科学研究所，重庆市农业科学院，
类型：发明
国别省市：
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