本发明专利技术公开了一个家蚕表皮蛋白BmCP274启动子，由SEQ?ID?No.1所示核苷酸序列组成；该启动子可以驱动外源蛋白在家蚕前部丝腺特异表达，可作为家蚕前部丝腺特异性启动子应用；本发明专利技术还公开了含有该启动子的重组表达载体，为下一步研究通过调控家蚕前部丝腺的离子通路蛋白表达来影响家蚕吐丝行为和改良丝纤维性能提供了有力的工具。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于生物
，涉及一种组织特异性启动子及其表达载体和应用。
技术介绍
家蚕在天然条件下产出的丝纤维是一种在纺织工业、生物医学等领域具有广泛应用的纤维材料。蜘蛛与家蚕具有相似的纺丝体，但其产出的丝纤维却较蚕丝具有更强的硬度和更出色的韧性。丝纤维在生物体内的形成是一个极其复杂的过程，至今都没有获得完全阐明。现有的合成纤维都是人工模拟昆虫天然产丝的过程，在体外进行合成，但是其力学性能还远不能和蜘蛛丝纤维进行对比。如果能使家蚕高效、特异地产出大量优质的类蜘蛛丝纤维，对于优质纤维材料的获取具有非常重要的意义。家蚕前部丝腺是向列型液晶形成的场所，离子强度对丝纤维的形成具有重要作用。利用家蚕前部丝腺特异启动子过量表达外源蛋白例如家蚕前部丝腺的某些离子通路蛋白，可能使丝纤维性质发生改变，获得更加优良的蚕丝纤维。
技术实现思路
有鉴于此，本专利技术的目的在于提供一种家蚕表皮蛋白启动子及其重组表达载体和应用，该启动子可以使外源蛋白在家蚕前部丝腺特异性表达，利用该启动子在家蚕前部丝腺调控某些离子通路蛋白的表达，可能使丝纤维性质发生改变，获得更加优良的蚕丝纤维。为达到上述目的，本专利技术提供如下技术方案I、家蚕表皮蛋白BmCP274启动子，由SEQ ID No. I所示核苷酸序列组成。2、含有所述家蚕表皮蛋白BmCP274启动子的重组表达载体。进一步，所述重组表达载体为pBac， 是将由家蚕表皮蛋白BmCP274启动子、表达基因序列和SV40终止信号组成的表达框 插入穿梭载体pSLfall80fa的多克隆位点中，获得重组载体 pSL ，再用Asc I从重组载体pSL 中切下片段，与同样经Asc I酶切的载体pBac 连接，即得。进一步，所述表达基因为红色荧光蛋白DeRed基因。3、所述家蚕表皮蛋白BmCP274启动子作为家蚕前部丝腺特异性启动子的应用。本专利技术的有益效果在于本专利技术利用蛋白质组学手段鉴定到一个在家蚕前部丝腺特异并且高量表达的表皮蛋白BmCP274，对其启动子序列进行了克隆，并以DsRed基因为代表基因构建了由BmCP274启动子调控的DsRed表达载体，将该表达载体显微注射入家蚕体内获得了转基因家蚕阳性个体，对该转基因家蚕阳性个体的研究发现，BmCP274启动子驱动 DsRed在家蚕前部丝腺特异表达，因此，BmCP274启动子可以作为家蚕前部丝腺特异性启动子应用。利用BmCP274启动子在家蚕前部丝腺调控某些离子通路蛋白的表达，可能使丝纤维性质发生改变，获得更加优良的蚕丝纤维，从而本专利技术为下一步研究通过调控家蚕前部3丝腺的离子通路蛋白表达来影响家蚕吐丝行为和改良丝纤维性能打下了基础，而本专利技术提供的含有BmCP274启动子的重组表达载体为上述研究提供了有力的工具。附图说明图I为BmCP274启动子转基因家蚕不同时期在白光和荧光照射下的照片，其中a 和b分别为白光和荧光照射下的卵，c和d分别为白光和荧光照射下的成虫，e和f分别为白光和突光照射下的家蚕苗壳。图2为BmCP274启动子转基因家蚕的丝腺解剖图，其中a和b分别为白光和荧光照射下的转基因家蚕丝腺，c和d分别为白光和荧光照射下的非转基因家蚕大造丝腺。图3为BmCP274启动子转基因家蚕的Southern blot分析，其中I为Tran 2K plus DNA Marker，2为经Bgl II酶切的非转基因家蚕大造蚕蛾DNA，3为经Bgl II酶切的转基因家蚕Gl代蚕蛾DNA，4为增强型绿色荧光蛋白(EGFP)基因(阳性对照)。图4为BmCP274启动子转基因家蚕在前部丝腺特异表达DsRed的Western blot 分析，其中I为转基因家蚕前部丝腺蛋白，2为非转基因家蚕大造前部丝腺蛋白。具体实施例方式为了使本专利技术的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合附图对本专利技术作进一步的详细描述。实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如分子克隆实验指南(第三版，J.萨姆布鲁克等著)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。实施例中使用的家蚕品种为大造，由中国西南大学家蚕基因资源库提供。一、家蚕表皮蛋白BmCP274启动子的克隆根据家蚕基因组数据库中序列nscaf 1681，设计I对上下游引物。设计的引物委托生工生物工程(上海)有限公司进行合成。引物序列如下274-F 5' -ttgtcgacgtagcctttacataatatgccg-3' (SEQ ID No. 2,下划线部分为 Sal I 酶切位点)；274-R :5’ -gaagatctctttcctggtgatcgatgg-3' (SEQ ID No. 3,下划线部分为 Bgl II 酶切位点)。以五龄第三天的大造基因组DNA为模板，采用引物274-F和274-R扩增BmCP274启动子片段(SEQ ID No. I)。PCR反应条件为94°C预变性4分钟；然后94°C变性40秒，51°C 退火40秒，72°C延伸I. 5分钟，共24个循环；最后72°C延伸10分钟。PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳分离，切胶回收纯化目的片段，再克隆入载体PMD19-T Simple(TaKaRa),获得重组载体 pMD19-BmCP274。二、BmCP274启动子调控的DsRed表达载体的构建将重组载体pMD19-BmCP274用Sal I和Bgl II双酶切，回收BmCP274启动子片段，再与同样经Sal I和Bgl II双酶切的载体pSL进行连接，获得重组载体 pSL。所述载体 pSL系参照文献方法(Horn and ffimmer, 2000),利用pSLfall80fa克隆穿梭载体,采用两步克隆法构建而得,具体构建方法见中国专利申请20110423280. 3。将重组载体pSL 用 Asc I 酶切，回收 BmCP274-DsRed_SV40片段，再与同样经Asc I酶切的载体pBac 进行连接，获得重组载体 pBac 。所述载体 pBac 系参照文献方法 (Horn and ffimmer, 2000)构建而得。三、BmCP274启动子调控的DsRed表达载体转基因家蚕的获得将重组载体pBac与编码piggyBac转座酶的转基因辅助载体pHA3PIG等摩尔比混合，通过显微注射入已解除滞育的大造早期胚胎(产卵后2飞小时，GO代)中，注射后的蚕卵用无毒胶水封口，25°C催青至孵化，孵化的幼虫采用人工饲料饲育，至成虫后进行自交制种，获得的卵期第7天的蚕卵(Gl代)在宏观体视荧光显微镜 (Olympus MVX10)下利用波长为46(T490nm的激发光检测绿色荧光，筛选出在眼睛或神经特异激发绿色荧光的转基因阳性个体(图I a-d)，即获得BmCP274启动子转基因家蚕。随机选取BmCP274启动子转基因家蚕Gl代蚕蛾，提取基因组DNA进行Southern blot检测，结果如图3所示，EGFP的插入拷贝数为I个，DsRed与EGFP处在同一个转座子区域中，其插入拷贝数也为I个，表明携带DsRed的piggyBac转座元件在BmCP274启动子转基因家蚕的基因组中发生了I次转座事件。四、BmCP274启动子调控的DsRed表达载体在转基因家蚕前部丝腺的特异表达I、荧光观察DsRed在转基因家蚕中的时期本文档来自技高网...
【技术保护点】
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：夏庆友，衣启营，赵萍，王鑫，马三垣，徐汉福，
申请(专利权)人：西南大学，
类型：发明
国别省市：
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