拆分荧光蛋白的融合蛋白的组合、其表达载体及用途制造技术

一种拆分荧光蛋白的融合蛋白的组合和其表达载体，以及在细胞融合时通过检测该拆分荧光蛋白的融合蛋白的组合中自我重新结合后的荧光蛋白的萤光来筛选病毒包膜蛋白的受体的方法，和筛选膜融合的促进剂或抑制剂的方法。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及一种拆分荧光蛋白的融合蛋白的组合及其表达载体，以及通过该拆分荧光蛋白的融合蛋白的组合筛选病毒包膜蛋白的受体的方法，和筛选膜融合的促进剂或抑制剂的方法。
技术介绍
膜融合是生物系统中非常普遍的现象。肌肉发生，受精作用，以及囊泡的运输过程中都涉及到膜融合。具有包膜的病毒侵染宿主细胞，同样依赖于膜融合。膜融合是由2个膜所分开的2个独立区室发生合并形成一个区室的过程。人们可以使用多种不同的技术监测这个过程。 一种方法是使用一对拆分蛋白，当它们相互重新结合的时候，将会重新获得其整体蛋白的活性。 在这类方法中已经建立了很多种报告蛋白系统。像天然就具有的自我组装能力的拆分P-半乳糖苷酶(P-gal)，以及拆分GFP蛋白(spGFP)都已应用于膜融合的分析中。拆分的酶可以实现定量的监测，但是如果使用的底物不具有膜通透性则需要破坏细胞膜才能实现。spGFP可以实现连续地观察活体细胞中发生的情况，但是其定量效果不如酶。 所以在现有技术里就不存在一种技术，即可以实现定量地监测体细胞融合又可以实现连续地观察活体细胞融合的蛋白或其组合以及方法。同时也缺乏一种简便地筛选病毒包膜蛋白的受体的方法，和一种简便地筛选膜融合的促进剂或抑制剂的方法。
技术实现思路
( — )专利技术的摘要[oooe](专利技术所要解决的问题) 本专利技术经过对大量拆分蛋白的研究和实验，发现在融合二种不同种类的拆分荧光蛋白的情况下，特别是这二种不同种类的拆分荧光蛋白中的至少一种为拆分荧光酶的情况下，就可以提供即可以实现定量地监测体细胞融合又可以实现连续地观察活体细胞融合的蛋白或其组合以及方法的技术。 本专利技术同时也发现了现有的荧光蛋白的新的拆分点。如果使用这个新的拆分点拆分的荧光蛋白作为拆分荧光蛋白的融合蛋白的组合的一部分，可以解决现有的问题。 (二)专利技术的详细说明 本专利技术的目的是提供一种拆分荧光蛋白的融合蛋白的组合，包括第一拆分荧光蛋白的融合蛋白和第二拆分荧光蛋白的融合蛋白，其中，第一拆分荧光蛋白的融合蛋白，为可自我重新结合的已被拆分的第一荧光蛋白的一部分和可自我重新结合的已被拆分的第二荧光蛋白的一部分的融合蛋白；第二拆分荧光蛋白的融合蛋白，为前述第一荧光蛋白的剩余部分和前述第二荧光蛋白的剩余部分的融合蛋白，其特征在于，前述的第一拆分荧光蛋白的融合蛋白与前述第二拆分荧光蛋白的融合蛋白结合后，前述第一荧光蛋白和前述第二荧光蛋白中的至少一个，可以自我重新结合恢复拆分前的荧光功能，从而发出荧光。4 本专利技术的另外一个目的是提供一种病毒包膜蛋白的受体的筛选方法，该方法包括以下步骤a)将本专利技术(权利要求5)所述的包膜蛋白表达载体转入第一细胞中表达，b)将本专利技术(权利要求5)所述的另外一个不含有包膜蛋白的基因的表达载体转入第二细胞中表达，该第二细胞同时含有该包膜蛋白所对应的受体，c)混合第一细胞和第二细胞，d)检验第一细胞和第二细胞通过病毒包膜蛋白与受体结合的方式融合后的荧光，该萤光为前述第一荧光蛋白和前述第二荧光蛋白中的至少一个自我重新结合后恢复的拆分前的萤光。 本专利技术的另外一个目的是提供一种膜融合的促进剂或抑制剂的筛选方法，该方法包括以下步骤a)将本专利技术(权利要求5)所述的包膜蛋白表达载体转入第一细胞中表达，b)将本专利技术(权利要求5)所述的另外一个不含有包膜蛋白的基因的表达载体转入第二细胞中表达，该第二细胞同时含有该包膜蛋白所对应的受体，c)加入促进或抑制病毒包膜蛋白与受体结合的促进剂或抑制剂，d)混合第一细胞和第二细胞，e).检验第一细胞和第二细胞通过病毒包膜蛋白与受体结合的方式而融合后的荧光，该萤光为前述第一荧光蛋白和前述第二荧光蛋白中的至少一个自我重新结合后恢复的拆分前的萤光。(具体实施形态) 以下通过提供本专利技术的具体实施形态来说明本专利技术，但是这里说明的具体实施形态只是本专利技术的一个实施例而已，不是用来限定本专利技术的范围以及其等同范围的。属于本
的技术者可以容易地理解本说明书所记述的专利技术范围以及本专利技术的等同范围。(第一实施形态) 本专利技术的第一实施形态为提供一种拆分荧光蛋白的融合蛋白的组合，包括第一拆分荧光蛋白的融合蛋白和第二拆分荧光蛋白的融合蛋白，其中，第一拆分荧光蛋白的融合蛋白，为可自我重新结合的已被拆分的第一荧光蛋白的一部分和可自我重新结合的已被拆分的第二荧光蛋白的一部分的融合蛋白；第二拆分荧光蛋白的融合蛋白，为前述第一荧光蛋白的剩余部分和前述第二荧光蛋白的剩余部分的融合蛋白，其特征在于，前述的第一拆分荧光蛋白的融合蛋白与前述第二拆分荧光蛋白的融合蛋白结合后，前述第一荧光蛋白和前述第二荧光蛋白中的至少一个，可以自我重新结合恢复拆分前的荧光功能，从而发出荧光。 本专利技术不局限特定的蛋白，可以使用的拆分荧光蛋白可以是现有的技术中存在的所有的可拆分的荧光蛋白(fluorescent)或是可拆分的冷光(luminescent)蛋白。本专利技术所采用的拆分荧光蛋白优选拆分荧光酶。因为通过加入酶的对应底物(substrate)就可以定量地测量拆分荧光酶的活性(activity)。 另外本专利技术中的所谓的「拆分」是指，在蛋白的氨基酸序列的一个点上将蛋白拆分为两部分，而这被拆分的两部分可能自我重新结合后恢复其原来的功能。这里所谓的「自我重新结合」包括自我重聚(self-reassociate)或是自我再组(self reassemble)等形式。 在本专利技术中优先采用的两种拆分荧光蛋白分别为，海肾荧光素酶(renillaluciferase， RU禾口绿色荧光蛋白(Green Fluorescent Protein, GFP)。本专利技术采用的海肾荧光素酶(renilla luciferase， RL)是可以通过使用具有膜通透性的底物endurene，在活体细胞中连续地监测膜融合的过程，从而定量地检测膜融合。RL是一种应用广泛的酶，已经建立了完善的检测系统。但是它的缺点在于拆分RL(spRL)具有众所周知较低的自我结合能力。因此为了增强spRL的自我结合能力，本专利技术采用了接合另外一个拆分荧光蛋白(spGFP)的方式。 本专利技术人通过大量的实验等在大量的可拆分的荧光蛋白中选定另外一个拆分荧 光蛋白，其为绿色荧光蛋白(GFP)。绿色荧光蛋白的拆分点有多种，本专利技术优选在拆分点位 于氨基酸序列的第157和第158之间的，这样就把绿色荧光蛋白拆分为GFP卜7和GFP8—1Q两 部分。这两部分自我结合后可以恢复原来的GFP的萤光功能是本专利技术人通过多种试验结果 首次发现的，是一种新颖的可拆分的绿色荧光蛋白的形态。 可以拆分为GFPh7和GFP8—1Q两部分的GFP不尽是一种新颖的可拆分的绿色荧光蛋 白而且是协助和增大被拆分的RL的恢复能力。所以，本专利技术的特征在于，第一拆分荧光蛋 白的融合蛋白和第二拆分荧光蛋白的融合蛋白里的spGFP各部分自我结合后可以恢复原 来的GFP的蛋白功能，同时，在spGFP的促进下spRL各部分自我结合后也可以恢复原来的 海肾荧光素酶(Renila luciferase， RL)的蛋白功能。 本专利技术采用的海肾荧光素酶(renilla luciferase，RL)的拆分点位于氨基酸序列 的第229和第230之间，把海肾荧光素酶拆分为nRL和cRL两部分。本专利技术采用的本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种拆分荧光蛋白的融合蛋白的组合，包括第一拆分荧光蛋白的融合蛋白和第二拆分荧光蛋白的融合蛋白，其中，第一拆分荧光蛋白的融合蛋白，为可自我重新结合的已被拆分的第一荧光蛋白的一部分和可自我重新结合的已被拆分的第二荧光蛋白的一部分的融合蛋白；第二拆分荧光蛋白的融合蛋白，为前述第一荧光蛋白的剩余部分和前述第二荧光蛋白的剩余部分的融合蛋白，　　其特征在于，前述的第一拆分荧光蛋白的融合蛋白与前述第二拆分荧光蛋白的融合蛋白结合后，前述第一荧光蛋白和前述第二荧光蛋白中的至少一个，可以自我重新结合恢复拆分前的荧光功能，从而发出荧光。

【技术特征摘要】
一种拆分荧光蛋白的融合蛋白的组合，包括第一拆分荧光蛋白的融合蛋白和第二拆分荧光蛋白的融合蛋白，其中，第一拆分荧光蛋白的融合蛋白，为可自我重新结合的已被拆分的第一荧光蛋白的一部分和可自我重新结合的已被拆分的第二荧光蛋白的一部分的融合蛋白；第二拆分荧光蛋白的融合蛋白，为前述第一荧光蛋白的剩余部分和前述第二荧光蛋白的剩余部分的融合蛋白，其特征在于，前述的第一拆分荧光蛋白的融合蛋白与前述第二拆分荧光蛋白的融合蛋白结合后，前述第一荧光蛋白和前述第二荧光蛋白中的至少一个，可以自我重新结合恢复拆分前的荧光功能，从而发出荧光。2. 根据权利要求1所述的一种拆分荧光蛋白的融合蛋白的组合，其中，前述第一荧光蛋白和前述第二荧光蛋白中的至少一个，是海肾荧光素酶(Renilla luciferase，RL)，其拆分点在氨基酸序列的第229和第230之间。3. 根据权利要求1所述的一种拆分荧光蛋白的融合蛋白的组合，其中，前述第一荧光蛋白和前述第二荧光蛋白中的至少一个，是绿色荧光蛋白，其拆分点在氨基酸序列的第157和第158之间。4. 一种表达载体的组合，包括第一表达载体和第二表达载体，其特征在于，第一表达载体包括表达前述第一拆分荧光蛋白的融合蛋白的基因，第二表达载体包括表达前述第二拆分荧光蛋白的融合蛋白的基因。5. 根据权利要求4所述的一种表达载体的组合，其中，前述第一表达载体和前述第二表达载体中的任一个为包膜蛋白表达载体，再包括了表达病毒包膜蛋白的基因，该包膜蛋白表达载体可以同时表达包膜蛋白以及第一拆分荧光蛋白的融合蛋白或第二拆分荧光蛋白的融合蛋白...

【专利技术属性】
技术研发人员：松田善卫，近藤直幸，岩本爱吉，
申请(专利权)人：国立大学法人东京大学，中国科学院生物物理研究所，
类型：发明
国别省市：JP[日本]