一种假单胞菌株和由其产生的低温脂肪酶及基因制造技术

本发明专利技术公开了一种假单胞菌（Pseudomonassp.）PF16和假单胞菌产生的脂肪酶及其基因；通过纯化得到的低温脂肪酶Lip-PF16具有良好的低温活性、酶活高，可广泛用于洗涤、食品加工、皮革加工、助消化剂、有机合成化工产品、香料、药物制备、油脂加工等行业。

【技术实现步骤摘要】
-种假单胞菌株和由其产生的低温脂肪酶及基因
本专利技术涉及酶基因工程和酶工程领域，具体涉及一株假单胞菌(AeWiZoffioaas sp. PF16,简称PF16)，及其脂肪酶基因和含有该酶基因的重组质粒和表达相应酶的重组菌株在 生产低温脂肪酶中的应用。
技术介绍
脂肪酶（Lipase，EC 3. I. L 3)是一类在油-水界面上催化天然油脂（甘油三脂） 降解为甘油和游离脂肪酸的酶，广泛存在于微生物和高等真核生物中。目前，工业上应用的 脂肪酶大多是由微生物产生，且基本上为胞外酶，产酶的最适温度多在30°C以上，而酶的最 适反应温度一般在40°C左右或更高，在0°C附近普遍丧失活性。总体而言，微生物脂肪酶具 有比动植物脂肪酶更广的作用pH、作用温度范围，高稳定性和活性、对底物有特异性。脂肪 酶反应条件温和，具有优良的立体选择性，并且不会造成环境污染。因此，在食品、皮革、医 药、饲料和洗涤剂等许多工业领域中均有广泛的应用。 脂肪酶可以将廉价的脂加工成昂贵的脂肪。可可脂是一种昂贵脂肪，它含有棕榈 酸和硬脂酸，熔点为37°C，在口中熔化时可以产生一种类似于巧克力的凉爽的口感。利用 脂肪酶的水解作用和合成反应，可以将棕榈油转化为类可可脂。比如利用米赫毛霉(ifocor 脂肪酶Lipozyme IM，可以使硬脂酸甲酯与33~39°C熔点棕榈油进行酯交换，制取类 可可脂。由于脂肪酶的交换作用，许多不饱和脂肪酸（PUFAs)越来越多地应用于营养业和 食品业中。微生物脂肪酶还应用于从动物脂质中获取PUFAs，例如鲱鱼油、金枪鱼油等。此 夕卜，脂肪酶在改变植物油物理性状方面也有很大的潜力。 传统的处理织物表面脂质的方法是用化学品脱除。但这种方法处理后的效果不理 想，且环境污染大，成本高。脂肪酶能将织物表面的脂质水解成易溶于水的脂肪酸，易于脱 除。EI-Syed等研究了脂肪酶处理羊毛毯的防缩性能，比未处理的羊毛缩水性有明显改善。 用脂肪酶和淀粉酶协同处理棉布纤维，棉布白度提高，颜色瑕疵少，更柔软舒适。 脂肪酶可以用做疾病诊断工具，它是一种重要的药物靶或中间体标记酶，可用来 预测疾病。通过测定脂肪酶催化甘油三酸酯产生的甘油可间接获得血清甘油三酸酯的含 量，血清中脂肪酶还可用于检测急性胰腺炎和胰腺损伤。Ahmed研究了脂肪酶和血清淀粉酶 测定胰腺炎的特异性，结果表明，胰腺炎病发后血脂肪酶明显升高，诊断有特异性，结果比 血清淀粉酶更可靠。经研究发现，从蜡蛀虫中提取的脂肪酶或酯酶，对分生杆菌属结核杆菌 iMercWiasis) H37Rv有杀灭作用。提取植物脂肪酶制成的药物，可改善 患者的消化吸收功能。美国俄勒冈州健康护理专业研究中心已有脂肪酶类药品上市，用于 治疗胃肠紊乱、消化不良等疾病。在手性药物合成中，用脂肪酶制备单异构体手性药物可提 高转化率、减少环境污染。 在工业上，脂肪酶作为洗涤剂的添加剂来水解脂肪。作为去污剂的添加剂所用的 脂肪酶必需具备以下几个条件：首先是底物特异性低，如可水解不同脂肪的混合物；其次 是可适用于不同的洗涤条件（ρΗ1(Γ?1，3(Γ6(Γ〇 ;再有就是可防止表面活性剂和蛋白酶的 破坏。目前还可通过连续筛选和蛋白质技术结合获得所需的脂肪酶。1994年,Novo Nordisk 首次合成了市售的重组脂肪酶（Lipolase)，它是真菌脂肪酶基 因在中表达获得的。 根据Margsin等人的定义，低温脂肪酶是指最适酶活温度在30°C左右，在(TC左右 仍有一定催化活性的脂肪酶。目前研究的低温脂肪酶普遍由低温微生物分泌产生，酶的最 适反应温度一般均低于40°C，而在(TC仍具高酶活。由于它们普遍具有低温下酶活力高、抗 有机溶剂等特点，因而成为了近年来酶学研究的一个热点。 低温脂肪酶主要有以下四个生理生化特点：（1)最适作用温度低或在低温下有高 催化活性是脂肪酶归类为低温脂肪酶的先决条件。（2)在低温下的具有高周转率（Kcat)和 高催化效率（Kcat/Km)是低温酶的主要适应特性，它们可以弥补低温导致化学反应速率降 低带来的影响，为生物提够足够的代谢活力并维持足够的代谢通量。高催化效率对所有低 温酶来说都是尤为重要的，因为它可以保证低温下底物与酶活性位点的充分结合。（3)结构 柔顺性是低温脂肪酶的另一个特点。低温脂肪酶柔顺、松散和开放的结构特征，有助于提高 酶分子在催化过程中的构象变化能力。（4)低温脂肪酶的热稳定性差。低温脂肪酶结构的 高度柔顺性可能造成蛋白的离子配位松散，并且由于缺乏二硫键及刚性的二极结构，导致 低温脂肪酶对热变性敏感，稳定性降低。 和其它低温酶相比较，低温脂肪酶不但具有其它低温酶的共同特征，而且还有自 己的一些独特的理化特征，归纳起来大致有以下几点：一是对有机溶剂有较好的耐受性，在 一定浓度的有机溶剂中，低温脂肪酶不仅不失活，酶活反而有所提高，这一特性为低温脂肪 酶今后在化学工业中的应用奠定了基础。二是大部分低温脂肪酶对链长为C3~C10的甘油 酯具有好的催化活性，这点与较偏好短链的酯类是不同。三是相对于高温和中温脂肪酶而 言，低温脂肪酶有更宽的PH适应范围，这进一步拓宽了它的工业应用范围。一般来说，酶的 理化特性是由其结构决定的，但对于如何从结构上解释低温脂肪酶的独特理化特性，根据 现有的研究结果还未能给出一个很好的解释，需要作进一步的研究。 近来低温脂肪酶的研究得到了快速发展，除了比较传统的研究方法如低温选育和 突变选育以外，随着现代生物技术和计算机技术的快速发展，对低温脂肪酶进行研究的方 法和手段有了飞速提高。利用现代计算机技术对低温脂肪酶的分子结构进行3D建模模拟 分析，已经从结构上解释了部分低温脂肪酶的低温适应机制和低温催化特性。而要进一步 解释清楚低温脂肪酶的理化和结构特征与低温适应性的关系，无疑DNA芯片，蛋白质芯片 以及晶体结构分析技术将是今后研究方法发展的方向。同样，针对低温脂肪酶的表达量低、 难纯化以及热稳定性差等问题也建立起了一些相应的研究方法。比如：利用基因工程手段 对低温脂肪酶分子进行克隆和异源表达使低温脂肪酶的产量提高，在纯化低温脂肪酶时对 传统的蛋白质纯化方法进行改进，利用酶的固定化技术改变低温脂肪酶的热稳定性等，运 用这些方法已在低温脂肪酶的分离和纯化以及相关研究中取得了一定成效。
技术实现思路
本专利技术的目的旨在提供一株假单胞菌sp. PF16,简称PF16)，该菌 株已经于2014年6月19日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址： 北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，保藏号为：CGMCC No. 9362。 本专利技术菌株是从4°C冷库中分离筛选到1株脂肪酶产生菌株，对该菌进行了形态 学和16S rRNA基因序列分析，并对该菌所产生的脂肪酶进行了部分酶学性质研究，主要包 括酶的热稳定性及pH稳定性。 为保证能正确克隆到假单胞菌PF16 sp. PF16)脂肪酶基因，采用了 PCR克隆拼接即运用BLASTp和ClustalX序列分析软件进行序列比对分析，通过比对假单胞 菌属的脂肪酶基因，找到它们的保守区域，然后根据保守序列设计简并引物本文档来自技高网...

【技术保护点】
一株假单胞菌（Pseudomonas sp. ）PF16，其在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的保藏编号为：CGMCC No.9362。

【技术特征摘要】
1. 一株假单胞菌sp. )PF16,其在中国微生物菌种保藏管理委员会普通 微生物中心的保藏编号为：CGMCC No. 9362。2. 由权利要求1所述的假单胞菌产生...

【专利技术属性】
技术研发人员：季秀玲，张传建，魏云林，王毅，马永凯，苏杨，林连兵，张琦，
申请(专利权)人：昆明理工大学，
类型：发明
国别省市：云南;53