一种基于荧光蛋白的夜明珠培育方法技术

本发明专利技术涉及生物技术领域，具体而言，涉及一种基于荧光蛋白的夜明珠培育方法。将含有荧光蛋白基因的质粒转入育珠珠贝组织后，对转染质粒后的育珠珠贝进行培育并进行制片、插片或插核，培育得到夜明珠。

Method for cultivating luminous pearl based on fluorescent protein

The invention relates to the field of biotechnology, in particular to a method for cultivating a luminous pearl based on fluorescent protein. The plasmid containing fluorescent protein gene into Pearl Zhubei tissue after transfection. The Pearl of pearl cultivation and production, insert or insert the nucleus, cultivated by a pearl.

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及生物
，具体而言，涉及一种基于荧光蛋白的夜明珠培育方法。
技术介绍
夜明珠是自然界的稀有珍宝，是人类宝贵财富，具有很高的投资与收藏价值。一颗重2800克，经光照15分钟即可在72小时内连续发光的浅灰色萤石“夜明珠”，被确认为当时世界上最大、价值连城的稀世珍宝。据说首次以4000万元人民币卖出，后来又以1800万美元的高价卖给了位法国收藏家。夜明珠来自具有磷光现象的矿物和岩石，较多的是萤石“夜明珠”。萤石硬度为4，因含各种稀有元素而常呈现浅蓝、翠绿、墨绿色。把萤石放到紫外线荧光灯下照一照，它会发出美丽的荧光。自然界有很多物质，受到外界能量(如热能、光能、电子束等)的激发，便发出肉眼可见的光，专业上称为“荧光(Fluorescence)”；如激发能量停止后还能继续发光的称为“磷光(Phosphorescence)”；发光能持续较长时间的称长余辉物质(BrightnessMatterforLongmorethenTime)。目前已发现萤石、金刚石、方解石，锂辉石等矿物质在外来能量的激发下能发出可见磷光。1973年，湖南省水产研究所的张元培先生用放射性同位素永久性发光粉等制备成珠核，然后将具有荧光特性的珠核和细胞小片移植到育珠蚌外套膜结缔组织中，以生产“夜明珠”(荧光珍珠)。从实践来看，以放射性元素作为发光体的夜明珠，一方面污染养殖环境，对生物产生毒害；另一方面，虽然据称放射性很低，但也有影响使用者身体健康的担忧，故没有得到应用和推广。如果能够运用现代高新技术，生产无毒无害，又能产生生物荧光的珍珠即“夜明珠”，将产生巨大的商业价值。有鉴于此，特提出本专利技术。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种基于荧光蛋白的夜明珠培育方法，所述的方法提供的夜明珠发光性质稳定，且没有放射性，对生物无毒害，具有非常高的观赏价值。在描述本专利技术的化合物、组合物、蛋白质、肽等以及方法之前，应当理解，这些实施方式不限于所描述的特定方法、方案以及试剂，这是因为它们可以变化。还应当理解，本文所使用的术语仅用于描述特定实施方式目的，并且不旨在限制本实施方式或权利要求的范围。为了实现本专利技术的上述目的，特采用以下技术方案：一种基于荧光蛋白的夜明珠培育方法，将含有荧光蛋白基因的质粒转入育珠珠贝组织后，对转染质粒后的育珠珠贝进行培育并进行制片、插片或插核，培育得到夜明珠。本专利技术生产出的夜明珠，绿色荧光蛋白嵌套进珍珠层中，蛋白处于与外界隔离的状态，不易降解，荧光不会萃灭。优选的，所述荧光蛋白选自绿色荧光蛋白、蓝色荧光蛋白、黄色荧光蛋白、橙色荧光蛋白、红色荧光蛋白以及光学加亮荧光蛋白中的一种或多种；更优选的，所述荧光蛋白为绿色荧光蛋白，所述质粒为pEGFP-C1。蓝色荧光蛋白可以选自EBFP、Azuritc、TagBFP等；黄色荧光蛋白可以选自EYFP、Ypct、PhiYFP等；橙色荧光蛋白可以选自mKO、mOrange、mBanana等；红色荧光蛋白可以选自TagRFP、mRuby、mCherry、mKatc。绿色荧光蛋白(greenfluorescentprotein，GFP)是本领域非常常见的一种荧光蛋白，由3个外显子组成，长2.6kb；是由238个氨基酸所组成的单体蛋白，相对分子质量为27.0kD(26888D)；其蛋白性质十分稳定，能耐受60℃处理。用6mol/L盐酸胍92℃，2min或酸处理(pH2)，5min变性后，GFP仍能复性恢复荧光，其半复性时间少于5min，在pH7.0时重新复性的GFP最大激发峰为398nm，发射峰为508nm，与天然GFP一样，抗胰蛋白酶水解处理。GFP的发光机制是GFP表达后折叠环化，在氧气存在的条件下，由65～67位的氨基酸残基(Ser-Tyr-Gly)环化，形成发色团(chromophore)，所以GFP基因表达后，一般有几小时的延迟期，才能观察到绿光。在紫外光激发下，GFP发出绿色荧光；其最大吸收峰在395nm，另一小吸收峰在470nm；最大发射峰为509nm。在不同的绝对温度下研究GFP的构象变化时发现，GFP存在高能量的B态和低能量的A态，Tyr66与A态有关，Ser65与B态有关。本专利技术所采用的GFP基因可以为本领域常用的类型，例如野生型的GFP基因；迄今GenBank中登录的野生型gfp基因完整编码序列有5条，其中的4条(GenBank：AEVGFPAM62653，AVGFP1X83959，AVGFP2X83960，AEVGFPL29345)都来自美国西海岸附近水域的发光水母AequoreaVictoria。对这4条序列进行核苷酸和氨基酸的比较，发现核苷酸的同源性在96％左右，238个氨基酸中有8个位点存在变异。另外一条是分离自中国厦门东海域的大型多管水母(Aequoreamacrodactyla)的野生型绿色荧光蛋白基因gfpxm(GenBank：AY013824)。也可以采用经过改造后的GFP基因，例如增强型GFP基因EGFP等。pEGFP-C1载体是由Clontech公司出品的表达载体，Clontech货号为6084-1。pEGFP-C1载体含有一个EGFP荧光蛋白序列,在哺乳动物细胞中能够表达出来EGFP荧光蛋白。pEGFP-C1在鱼类等及软体动物中已经得到很好地应用。优选的，如上所述的基于荧光蛋白的夜明珠培育方法，所述育珠珠贝组织选自育珠珠贝的胚胎，或贝类性腺、外套膜及其离体组织中的一种或几种。优选的，如上所述的基于荧光蛋白的夜明珠培育方法，所述将质粒转入育珠珠贝组织的方法为电穿孔法、显微胚胎注射法或直接注射法。优选的，如上所述的基于荧光蛋白的夜明珠培育方法，所述质粒浓度为5～15％；导入剂量50～200ul。优选的，如上所述的基于荧光蛋白的夜明珠培育方法，所述电穿孔法的条件为：电场强度20～150V/cm；电穿孔1～8次，每次间隔1～2分钟，每次电击10～80毫秒。更优选的，所述电穿孔法的条件为：电场强度60～120V/cm；电穿孔3～8次，每次间隔1～2分钟，每次电击30～50毫秒。优选的，如上所述的基于荧光蛋白的夜明珠培育方法，将含有绿色荧光蛋白基因的质粒转入育珠珠贝组织之前，还包括：洗净蚌体或组织并降温至6～15℃。优选的，如上所述的基于荧光蛋白的夜明珠培育方法，所述育珠珠贝包括珍珠蚌科、蚌科、牡蛎科或珍珠贝科。优选的，如上所述的基于荧光蛋白的夜明珠培育方法，所述育珠珠贝选自三角帆蚌、池碟蚌、褶纹冠蚌、无齿蚌、丽蚌、大珠母贝、黑蝶贝、马氏珠母贝(Pinctadafucata)、企鹅珍珠贝。如上所述的基于荧光蛋白的夜明珠培育方法培育得到的夜明珠。本专利技术提供的基于荧光蛋白的夜明珠培育方法所制备的夜明珠发光性质稳定，且没有放射性，对生物无毒害，具有非常高的观赏价值，是一种非常值得推广的夜明珠生产方法。具体实施方式除非另有限定，本专利技术使用的所有技术和科学术语具有与所公开的实施方案所属领域的普通技术人员通常理解的相同的含义。虽然与本专利技术所述的方法和材料类似或等同的方法和材料可用于本实施方式的实践或测试中，但下文仍然描述了合适的方法和材料。本专利技术提及的所有出版物、专利申请、专利以及其他参考文献通过引用全部内容结合于本文中。在冲突的情况下，本说明书(包括定义)本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种基于荧光蛋白的夜明珠培育方法，其特征在于，将含有荧光蛋白基因的质粒转入育珠珠贝组织后，对转染质粒后的育珠珠贝进行培育并进行制片、插片或插核，培育得到夜明珠。

【技术特征摘要】
1.一种基于荧光蛋白的夜明珠培育方法，其特征在于，将含有荧光蛋白基因的质粒转入育珠珠贝组织后，对转染质粒后的育珠珠贝进行培育并进行制片、插片或插核，培育得到夜明珠。2.根据权利要求1所述的基于荧光蛋白的夜明珠培育方法，其特征在于，所述荧光蛋白选自绿色荧光蛋白、黄色荧光蛋白、橙色荧光蛋白、红色荧光蛋白以及光学加亮荧光蛋白中的一种或多种；优选的，所述荧光蛋白为绿色荧光蛋白，所述质粒为pEGFP-C1。3.根据权利要求1所述的基于荧光蛋白的夜明珠培育方法，其特征在于，所述育珠珠贝组织选自育珠珠贝的胚胎，或贝类性腺、外套膜及其离体组织中的一种或几种。4.根据权利要求3所述的基于荧光蛋白的夜明珠培育方法，其特征在于，所述将质粒转入育珠珠贝组织的方法为电穿孔法、显微胚胎注射法或直接注射法。5.根据权利要求4所述的基于荧光蛋白的夜明珠培育方法，其特征在...

【专利技术属性】
技术研发人员：张根芳，
申请(专利权)人：金华职业技术学院，
类型：发明
国别省市：浙江;33