本发明专利技术公开一种动物狂犬病中和抗体间接ELISA检测试剂盒，该试剂盒的酶标板包被了用线性蔗糖梯度区带离心法纯化的狂犬病病毒全病毒颗粒，此包被抗原纯度高，可检测包括狂犬病病毒糖蛋白、核蛋白等蛋白产生的抗体，研究发现本发明专利技术的试剂盒特异性达到100％，灵敏度最低检出量为0.0625IU/ml，变异系数CV(重复性)为2.74％，稳定性良好。该试剂盒操作简单，成本低，适合推广使用。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及分子生物学和生物
，具体地，涉及一种用间接酶联免疫吸附方法(ELISA)检测动物狂犬病中和抗体的试剂盒及其制备方法。
技术介绍
狂犬病是由狂犬病病毒(Rabies virus,RV)感染引起的人畜共患的急性高度致死性传染病，广泛流行于世界各地，据世界卫生组织(WHO)最新的不完全统计资料报道，全世界每年约有5. 5万人死于狂犬病，我国每年的死亡人数位列世界第二位，且最近几年死亡人数居高不下。而正是狂犬病病毒在动物之间的传播流行直接导致了人狂犬病的流行，预防人得狂犬病，首先应当控制和消灭动物得狂犬病，即消灭传染源。因此要从根本上预防狂犬病的发生，控制和消灭狂犬病必须对犬和野生动物实行全面的综合预防措施。研究表明狂犬病的控制，最积极有效的措施就是加强犬的免疫。疫苗接种后，并不是所有动物都会产生免疫反应，产生抗狂犬病毒抗体。只有经过检测，产生了达到保护水平的狂犬病毒抗体的动物才能确保不发生狂犬病。评价狂犬病疫苗的免疫效果，主要以免疫后出现抗狂犬病毒抗体为指标，尤其抗体出现的时间、水平和持续时间更为重要。因此应该在接种疫苗后一个月，进行狂犬病毒抗体检测，如果不能产生保护性狂犬病毒抗体，就应该重新或加强免疫，确保免疫效果。WHO狂犬病专家委员会推荐小鼠中和实验(MNT)和快速荧光灶抑制实验(RFFIT)作为检测狂犬病毒(RV)中和抗体的两项基本方法，并为其它方法的基准和参考。但是，无论是MNT法还是RFFIT法，分别需要21d 和2d以上的实验观察时间，需要组织细胞培养和昂贵的荧光显微镜来配合使用，进行试验结果的判断。荧光抗体病毒中和试验(FAVN)操作繁琐，对操作者操作技能要求高，且存在生物安全和人为判断误差的问题。ELISA是一种基于抗原抗体特异性反应的检测方法，其优点是敏感、特异、安全、操作简单快速，在很多疾病的临床诊断与流行病学调查等方面得到了广泛的应用，适用于大批量标本的检测，是较为理想的病原或抗体检测方法。ELISA检测方法对包被抗原的纯度要求较高，现有技术中纯化狂犬病毒的方法主要有离子交换层析纯化法、凝胶(分子筛)层析纯化法等，其不足之处是抗原纯度较低，且操作复杂，不利于保持生物大分子活性和节约成本，因此寻找一种经济、简便、高效纯化狂犬病病毒的方法成为制备检测狂犬病中和抗体 ELISA试剂盒的迫切需要。法国Synbiotics公司生产的狂犬病抗体检测试剂盒是世界动物卫生组织(OIE) 唯一推荐的ELISA检测试剂盒，但该试剂盒价格昂贵，为8800元人民币，导致检测成本高不利于推广使用。开发一种可以快速准确，成本较低的ELISA检测方法测定狂犬病中和抗体具有重要的实际应用价值，且对于构建动物防疫监测体系和保障公共卫生安全意义重大。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供检测动物狂犬病中和抗体间接ELISA检测试剂盒及其应用。本专利技术试剂盒酶标板的包被抗原为狂犬病病毒全病毒颗粒，该抗原是采用微载体悬浮培养的狂犬病毒收获液经过超滤、澄清、灭活、线性蔗糖梯度区带离心纯化后得到的。本专利技术使用的狂犬病病毒为狂犬病毒固定毒(CTN-1株)，在Vero细胞上培养、扩增，经超滤、澄清、线性蔗糖梯度区带离心浓缩提取，包括以下步骤1)微载体上Vero细胞长成单层后，按0. 03 0. 3感染复数的比例接种狂犬病毒， 在温度32 36°C、转速20 80r/min、pH 7. 20 7. 80、溶氧20% 70%、添加0. 05% 5%牛血清白蛋白的199培养基的条件下培养，培养4-6日后开始收获上清液至细胞完全脱落为止；2)将病毒收获液用0. 1 0.45 μ m滤芯过滤澄清后，用100KD 300KD膜包，超滤浓缩；3)向狂犬病毒浓缩液中加入β-丙内酯，在2 8°C条件下灭活，37°C水解；4)狂犬病毒灭活液用线性蔗糖梯度进行区带离心，4°C，20000 50000r/min ；离心1 5小时，离心后泵入60%蔗糖溶液，收集狂犬病毒富集峰，得到的狂犬病毒离心液用截留分子量为100KD 300KD膜包超滤浓缩，PBS溶液透析脱糖，得到狂犬病毒纯化液。本专利技术试剂盒还包括酶标二抗、样品稀释液、标准血清、阳性血清、阴性血清、显色剂、终止液和洗涤液。本专利技术使用的酶标抗体为辣根过氧化物酶记羊抗犬IgG抗体；标准血清的制备是将狂犬病病毒灭活抗原三针免疫程序接种比格犬，当血清效价高于6. 0IU/ml时，1周后采血分离血清，56°C灭活30分钟；本专利技术试剂盒所用的阳性血清为狂犬病病毒CTN-I株灭活抗原免疫犬后获得的血清，测定血清狂犬病毒抗体水平；所述阴性血清为未感染狂犬病病毒且未免疫过狂犬病疫苗的健康犬血清。当标记酶为辣根过氧化物酶时，本专利技术试剂盒所用的显色剂由底物A液和底物B 液组成，底物A液含有柠檬酸钠、双氧水等，底物B液为TMB ；终止液为2mol/L硫酸溶液；所述洗涤液为含有的Tween-20的PBS缓冲液。一种制备本专利技术试剂盒的方法，包括1)狂犬病病毒灭活后，用线性蔗糖梯度区带离心纯化，纯化的狂犬病全病毒颗粒与包被缓冲液配成合适浓度，包被酶标板；2)辣根过氧化物酶标记羊抗犬IgG，获得酶标二抗；3)狂犬病抗体检测阴阳性对照血清的制备，按常规方法制备狂犬病抗体检测阴性对照血清、狂犬病抗体检测阳性对照血清和狂犬病抗体标准血清；4)配制试剂，按配方配制封闭液、洗涤液、样品稀释液、酶标二抗稀释液、底物显色液、终止液；5)试剂盒组装，将纯化的狂犬病全病毒颗粒包被的酶标板、酶标二抗、狂犬病抗体检测阴阳性对照血清、标准血清及封闭液、洗涤液、样品稀释液、酶标二抗稀释液、底物显色液、终止液按试剂盒配制定量分装。其中步骤1)所述的纯化狂犬病全病毒的包被浓度为2 μ g/ml。本专利技术还提供了该试剂盒在检测动物狂犬病病毒中和抗体中的应用。采用狂犬病毒全病毒颗粒包被酶标板，以中和抗体效价分别为0.04IU/ml， 0. 02IU/ml，0. 01IU/ml，0. 005IU/ml，0. 0025IU/ml，0. 00125IU/ml,0. 000625IU/ml 的血清作为标准，使用标准血清和待检血清分别与包被抗原反应后，加入辣根过氧化物酶标记羊抗犬IgG抗体，反应结束显色后根据OD值和标准血清中和抗体效价，计算待检血清的中和抗体效价，从而定量确定动物的狂犬病疫苗免疫水平。本专利技术提供的试剂盒利用辣根过氧化物酶标记羊抗犬IgG抗体、标准血清和包被抗原，能够简单快速准确定量的检测犬血清中的狂犬病中和抗体。经各项标准验证，该试剂盒表现为具有良好的特异性，较高的敏感性，较好的重复性和稳定性，其中对阴性血清检测符合率为100%，对目标动物的其他常见疾病血清抗体不具有交叉反应。敏感性的灵敏度最低检出限量为0. 0625IU/ml，试剂盒检测的重复性好，变异系数CV为2. 74%，37°C放置14 天和2 8°C放置390天后，试剂盒敏感性和特异性检测结果均符合试剂盒质量标准，能准确快速地检测狂犬病抗体水平，避免假阴性结果的出现，且由于纯化方法先进，所以成本相对于其他检测方法降低很多，适用于大批量标本的检测。本专利技术对狂犬病病毒使用线性蔗糖梯度区带离心纯化方法，其中杂蛋白Vero细胞宿主蛋白残留量比其他厂家的显著降低约3000ng/ml左右本文档来自技高网...
【技术保护点】
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：王海霞，陈静，岳雷，李淑芬，张振山，
申请(专利权)人：唐山怡安生物工程有限公司，
类型：发明
国别省市：
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