本发明专利技术提供了一种利用生物反应器制备猪乙型脑炎灭活疫苗的方法，其是利用生物反应器和Cytodex-1微载体系统，用抗原性好的P3株乙脑病毒，对乙脑病毒P3株适应的高密度Vero细胞进行病毒感染，根据乙脑病毒P3株在Vero细胞上的增殖情况，待细胞病变达一定程度后收获病毒液，使传统病毒滴度从105-6PFU/ml提高到107-8PFU/ml以上，病毒含量提高10倍以上。将收获的病毒液灭活后，加入佐剂定量分装即可获得高质量的疫苗成品。制得的疫苗安全、有效，生产工艺稳定，质量可控。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及一种疫苗的制备方法，具体地说，涉及一种。
技术介绍
猪乙型脑炎又称日本乙型脑炎，是一种由日本乙型脑炎病毒引起的蚊媒性人畜共患病毒性传染病。主要通过吸血昆虫(主要为蚊子)叮咬，以猪-蚊-猪循环扩大病毒的传播，使其成为乙型脑炎病毒的主要增殖宿主和传染源。各种年龄、品种、性别的猪均易感染此病，患病种猪可垂直传播传给仔猪。该病夏秋季节流行，南方6 7月，东北8 9月达到高峰。在我国规模型养猪场中广泛存在，呈地方性流行，北京、云南、湖南、湖北、福建、广东、广西、山西、山东、吉林、甘肃、河北等省份均报道从猪体内或蚊体内分离到乙型脑炎病毒。猪乙型脑炎无特效治疗药，最主要的防治措施为免疫接种。目前乙脑疫苗主要有三种日本的鼠脑纯化疫苗、中国的SA14-14-2株减毒活疫苗及灭活疫苗。乙脑组织灭活苗虽然安全可靠，但生产成本高，存在大量无关抗原成分，副作用明显。弱毒疫苗虽然保护性好，但可能出现潜在的毒力返强、带毒、排毒、垂直传播等不安全因素，而利用原代地鼠肾细胞生产乙型脑炎灭活疫苗的工艺，很难提高抗原含量和控制疫苗质量，因此，寻找一种安全、有效的乙脑灭活疫苗的生产方法成为亟待解决的问题。
技术实现思路
本专利技术旨在克服已有的猪乙脑灭活疫苗制备方法中存在的不足，提供一种新型的、安全、有效的猪乙脑灭活疫苗的制备方法。为了实现本专利技术目的，本专利技术的一种，其是利用生物反应器和Cytodex-I微载体系统，用乙脑病毒P3株对密度可达I 7 X 106/ml的乙脑病毒P3株适应的Vero细胞进行病毒感染，培养条件为34 ± 2°C，pH值7 8，待细胞病变达到75%以上时，收获含有乙脑病毒的培养液，然后对收获的病毒培养液进行灭活。其中，乙脑病毒P3株对Vero细胞进行病毒感染的接种比例为O. 005 O. 5M. O. I。优选地，使用β_丙内酯灭活病毒，使用量为β_丙内酯病毒液(V : V)=O. 1-2 4000，更优选地，β-丙内酯病毒液(V : V) = I : 4000。前述的方法，其还包括最后向病毒灭活液中加入氢氧化铝胶和硫柳汞的步骤。优选地，氢氧化招胶和硫柳萊的终浓度分别为O. 6-1. 2mg/ml和O. lmg/ml。借由上述技术方案，本专利技术至少具有下列优点及有益效果本专利技术利用生物反应器和Cytodex-I微载体系统，用抗原性好的P3株乙脑病毒，对乙脑病毒P3株适应的高密度Vero细胞进行病毒感染，根据乙脑病毒P3株在Vero细胞上的增殖情况，待细胞病变达一定程度后收获病毒液，使传统病毒含量从105_6PFU/ml提高到107_8PFU/ml以上，病毒含量提高10倍以上。将收获的病毒液灭活后，加入佐剂定量分装即可获得高质量的疫苗成品。制得的疫苗安全、有效，生产工艺稳定，质量可控。另外，与传统生产工艺相比，本专利技术改进了培养系统的氧传递方式，减少了剪切力，降低有害代谢废物浓度。由于可模拟空间中的微重力环境，使培养物的重力向量在旋转过程中产生随机化，导致一定程度的重力降低，使细胞处于一种模拟自由落体状态，以此模拟微重力环境。由于没有搅拌剪切力影响，细胞可以在相对温和的环境中进行三维生长，同时在动物细胞培养过程中，葡萄糖代谢和谷氨酰胺代谢密切相关。通过控制葡萄糖和谷氨酰胺浓度可控制乳酸和氨等有害代谢物的产生浓度，可有效控制细胞生长状况。大规模连续灌流培养高密度宿主细胞，细胞密度可达7X106/ml，这种成本低、易于操作的细胞能量代谢转移研究方法，为实现高密度、高产率的细胞培养优化工艺提供了广阔的应用前景。附图说明图I为本专利技术方法制得的猪乙型脑炎灭活疫苗的动物学免疫实验结果。具体实施例方式以下实施例用于说明本专利技术，但不用来限制本专利技术的范围。以下实施例中使用的非洲绿猴肾细胞(Vero细胞)购自ATCC, Cytodex-I微载体系统购自Amersham公司，乙脑病毒P3株购自中国药品生物制品检定所。实施例I乙脑病毒P3株适应的VeiO细胞传代扩增培养将乙脑病毒M53代P3株乙型脑炎病毒种子用标准MEM培养基稀释后，脑内接种乳鼠，采集死亡小鼠脑组织，研磨制成脑组织悬液，离心，取上清制成乙型脑炎鼠脑病毒。将制备成的乙型脑炎病毒鼠脑悬液用细胞维持液进行适当稀释后，接种长成单层的Vero细胞，在34. 0±2. (TC进行病毒培养，培养至细胞病变达75%左右时收获病毒上清液，按照上述方法，将P3株乙型脑炎病毒在Vero细胞中连续传代，测定病毒含量在107 0PFU/ml以上。表明乙脑病毒P3株对Vero细胞敏感，可以用于疫苗的生产。实施例2利用生物反应器和Cytodex-I微载体系统进行Vero细胞培养生物反应器工作体积IOL 500L，Cytodex-I微载体系统使用10g/L，细胞密度由5 X IO5 递增至Ij 5 7 X IO6。实施例3接种乙脑病毒P3株对Vero细胞进行病毒感染当细胞长成单层时，按照接种O. 005 O. 5M. O. I进行P3株乙脑病毒感染，根据测定培养基(含有5-10%牛血清的标准MEM培养基)中葡萄糖浓度、乳酸盐浓度、谷氨酰胺、耗氧速率以及PH值指标来控制；病毒培养温度控制在34. O±2. 0°C，pH值为7 8，20 60转/分，溶氧10 100%。实施例4病毒液的超滤浓缩、灭活及疫苗成品的制备接种病毒后，待细胞病变达到75%以上时收获含有乙脑病毒的培养液，按O.l-2ml/4000ml病毒液的量加入β -丙内酯进行灭活。然后，向病毒灭活液中加入终浓度为O. 6-1. 2mg/ml氢氧化铝胶和O. lmg/ml硫柳汞，充分摇匀，经灌装后即为猪乙型脑炎灭活疫苗成品。实施例5猪乙型脑炎灭活疫苗的制备I病毒与细胞用于制备猪乙型脑炎灭活疫苗的病毒株为具有良好抗原性的乙脑病毒P3株，以对该病毒株具有良好敏感性的细胞系Vero细胞，作为制苗用细胞系，以感染并大量繁殖乙脑病毒。2毒种制备将制备疫苗用的细胞系Vero细胞接种到含5_10%新生牛血清的标准MEM培养基中，Cytodex I微载体浓度为10g/L，在温度:37. 0 + 2. 0°C，pH值7-8，搅拌速度20-60转/分条件下培养。待微载体上的Veix)细胞长成单层，弃去生长液，按O. 1%的比例接种基础毒种，在34. 0±2. (TC条件下进行培养，待细胞病变达到75%以上收获上清液。按照上述方法，病毒在细胞上连续传代，测定病毒含量在107_°PFU/ml以上，表明病毒适应Vero细胞，即完成乙脑病毒适应Veix)细胞的传代，可用于建立病毒基础毒种和生产毒种。3连续的细胞培养Vero细胞接种到装有浓度为10g/L的Cytodex I微载体的IOL生物反应器中，采用含有10%牛血清的标准MEM培养基培养，温度37. O±2. 0°C，pH值7_8，溶氧40-70%，搅拌速度20-60转/分。连接程序控制软件，通过计算机在线监控。根据细胞生长情况使用含10%牛血清的标准MEM培养基进行灌流培养。4收获感染病毒待微载体上的VeiO细胞长成单层，弃去生长液，接种O. 5M. O. I (感染复数)的生产用毒种，采用含有2-5%牛血清的标准MEM培养基，于34. O±2. (TC，pH为7_8，溶氧50-70%，搅拌速度20-60转/本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种利用生物反应器制备猪乙型脑炎灭活疫苗的方法，其特征在于，其是利用生物反应器和Cytodex?1微载体系统，用乙脑病毒P3株对连续灌流式培养的密度为1～7×106/ml的乙脑病毒P3株适应的Vero细胞进行病毒感染，培养条件为34±2℃，pH值7～8，待细胞病变达到75％以上时，收获含有乙脑病毒的培养液，然后对收获的病毒培养液进行病毒灭活。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：岳雷，郭鑫，陈静，李淑芬，韩中山，张振山，
申请(专利权)人：唐山怡安生物工程有限公司，
类型：发明
国别省市：
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