用于经典猪瘟的标记疫苗制造技术

本发明专利技术涉及一种用于预防性治疗经典猪瘟的标记疫苗，其包含修饰的减毒活经典猪瘟病毒。E2蛋白的TAV-表位的病毒氨基酸序列包含与野生型经典猪瘟病毒不同的序列。本发明专利技术涉及这种标记疫苗的药物组合物。本发明专利技术还涉及一种使用选择性抗体压力制造用于预防经典猪瘟的标记疫苗的方法。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】用于经典猪瘟的标记疫苗描述本专利技术涉及一种用于预防性治疗经典猪瘟的标记疫苗，其包含修饰的减毒活经典猪瘟病毒。在本专利技术的一个实施方案中，这种标记疫苗的特征在于，编码TAV-表位的病毒核苷酸序列和/或TAV-表位的氨基酸序列包含与疾病相关性猪瘟病毒不同的序列，从而可以通过血清学和/或基因组分析方法，将显示疾病相关性猪瘟病毒感染的受试者与用本专利技术标记疫苗接种的受试者区分。专利技术背景 经典猪瘟(CSF)是在世界范围发生并且具有重大政治及经济意义的一种流行性动物疾病(Vand印utte和ChappuiS，1999)。经典猪瘟，也称作猪霍乱或猪瘟疫(pigplague)，是一旦在任何成员国中出现必须在欧盟层面以及向世界动物卫生组织(OIE)作出国际通报的疾病之一。经典猪瘟由黄病毒科(Flaviviridae)瘟病毒属(Pestivirus)的一种小的包膜RNA病毒引起。猪瘟病毒的天然宿主仅是家养和野生的猪物种(例如，欧洲野猪)。已经在欧盟内部尝试在不预防性接种情况下通过严厉措施根除CSF，自1990以来已经禁用预防性接种。尽管禁用，然而作为紧急接种，在猪瘟出现的情况下，接种仍代表法律批准的选项。在这种情况下中，接种应当通过紧急接种计划之一进行，这些计划已经由欧盟批准(见理事会指令第19号，2001/89/EC)。直至现在，罗马尼亚是已经实施过紧急接种的唯一国家。这种有限应用的原因在于当前可获得的标记疫苗的技术性约束，如疫苗效力限制，此外还有涉及常规接种动物的贸易壁垒(对国际销售的限制)。许可的标记疫苗的效率不能与显示明显优点的修饰的活疫苗相比，并且这些灭活疫苗或亚单位疫苗无论如何不适合用于紧急接种，原因在于免疫力发动较晚和需要再接种。考虑欧盟向东欧国家扩大和日益增加的全球化，已经讨论了用于潜在紧急接种的新策略，其将在避免大规模剔除动物和相关经济损失方面发挥重要作用的(Leifer等人，2009)。因此对于高度有效的疫苗存在迫切需要，这种疫苗允许在接种和未接种的动物之间进行血清学区分并且还显示传统修饰的活疫苗的全部优点。因为基于CSF病毒E2糖蛋白的第一代标记疫苗仅具有受限制的可获得性和严重缺点，如储存条件、成本、效力，所以对新的标记疫苗存在巨大需求。已经研究了这类疫苗的多种候选物，如DNA疫苗、免疫原性肽、载体疫苗、缺失突变体和嵌合猪瘟病毒(Beer等人，2007 ；Dong和Chen, 2007)。这些标记疫苗候选物的大部分显示以下缺点它们通过现代基因修饰方法产生。除复杂的准许程序之外，还由于顾客明显惧怕基因修饰的产品，基因修饰的疫苗显示明显的缺点。针对CSFV的传统疫苗包括修饰的活疫苗。这类疫苗在单次应用后是高度有效的，但是不允许基于血清学谱区分接种动物和感染动物。这些疫苗中的多种基于经典毒株“C”或其衍生物(所谓“C-株疫苗”)。另外，存在基于日本毒株“豚鼠兴奋阴性(GPE-)”、“Thiverval”株和“墨西哥PAV”株的疫苗，这些疫苗均已经在地区和国际环境下使用(Blome 等人，2006 ;Greiser_Wilke 和 Moennig, 2004 ；van Oirschot, 2003)。的确存在关于使用C-株疫苗的广泛数据。已知在应用这种疫苗4日后，可以显示动物受到抗强毒CSFV攻毒感染的完全保护。另外，接种后7日，在携带动物中提供免于攻毒病毒垂直传播的完全保护(de Smit 等人，2001)。已知的修饰活疫苗的明显缺点是完全不能血清学地区分接种动物和感染动物。有鉴于此，本专利技术的一项任务是提供一种能够区分接种动物和感染动物的修饰活疫苗。在标记疫苗领域，所谓的亚单位疫苗是现有技术已知的，这些亚单位疫苗基于CSFV的重组E2糖蛋白。这类疫苗的区分试验是酶联免疫吸附测定(ELISA)，其中针对Ems糖蛋白的抗体用来间接地检测CSF病毒感染。在目前，仅一种E2-亚单位疫苗是市场上可获得的，然而，许可证延迟了几个月(见EMA (欧洲药品管理局)关于E2亚单位疫苗的报道)。姑且不论不能销售这类产产品，这些系统显示严重的生物学缺点。一个这样的缺点是，在传递完全保护之前需要至少两次肠胃外免疫，这导致此类疫苗与以单次剂量用疫苗饵料饲喂动物的“饵料接种法”完全不匹配。此外，紧急接种计划仅在多个实验中使用针对野生型CSFV的E2亚单位疫苗保护时，没有实现免遭垂直传播的完全保护的情况下才是合理的。这类系统的另一个缺点是，针对糖蛋白Ems的抗体用于血清学区分并且这类检验体系的灵敏度和特异性仅是略微中等的(Floegel-Niesmann，2003)。活的减毒CSF疫苗是本领域已知的，但是至今受困于多种缺点。现有技术中公开的大部分疫苗包含外来DNA并且使用基因工程方法(也称作重组DNA技术)产生，因此严重的环境风险评估问题伴随这种产品。已知其中从野生型TAV表位中置换或缺失氨基酸的其他CSFV变体(WO 2010/074575A2)。然而，在本专利技术中修饰的氨基酸残基和/或核苷酸在现有技术中既没有公开，有没有提示。多次传代也已经被用来产生可以用作疫苗的病毒变体，不过先前没有应用抗体压力。如现有技术中公开的旨在产生变体的病毒感染培养物的多次传代因此受到以下限制不得不实施大量培养物传代并且还无法控制将要修饰哪个表位(Hulst等人)。Kortekaas等人描述一种遗传稳定的、活的减毒CSF疫苗，所述疫苗能够血清学地将感染动物与接种动物区分。将突变的C-株使用定向方法进行基因修饰，由此使用重组DNA技术来将缺失引入CSFV的E2蛋白中。通过多次传代在病毒基因组内部的多个位置随后获得其他突变，以产生显示增殖增强的毒株。在Kortekaas等人中公开的毒株是基因修饰的病毒，考虑到用于释放基因修饰产物至环境中的复杂准许过程，这是一个明显缺点。Holinka等人公开了一种减毒的双抗原标记活CSFV毒株“FlagT4vn”，其中通过组合两个减毒遗传定子获得所述毒株。FlagT4v携带通过在El糖蛋白中19聚物插入所导入的阳性抗原标记(合成性Flag表位)和因突变E2糖蛋白中的单克隆抗体WH303(mAbWH303)表位的结合位点所产生的阴性标记。鼻内或肌内施用FlagT4v保护猪在接种后早期(2或3H )和晚期(28 H )时间免遭强毒CSFV Brescia株影响。FlagT4v在猪中诱导针对Flag表位强烈反应的抗体应答，但是不能抑制mAb WH303与代表WH303表位的合成肽结合。在Holinka中公开的疫苗涉及一种基因工程病毒，所述病毒在其基因组内显示外来DNA(除相关的载体序列和标记之外还有FLAG-标签序列)。与不显示外来或重组DNA的本专利技术相比，这表示一个明显缺点。文献WO 2007/143442A2描述了在CSFV E2的WH303表位内部突变的效果，所述突变将强毒Brescia CSFV的氨基酸序列逐步向BVDV毒株NADL的同源性氨基酸序列改变。在接种后第3日和21日用强毒Brescia病毒攻毒时，被病毒突变体感染的动物受到保护。在WH303表位内部这个位点处的修饰还导致开发区分接种动物与感染动物的诊断试验。即便存在这些效果，然而使用基因工程引入这些突变，因此将外来遗传物质导入病毒疫苗中。上述的现有技术公本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】...

【专利技术属性】
技术研发人员：马丁·贝尔，桑德拉·布洛梅，伊曼纽尔·莱费尔，
申请(专利权)人：里姆瑟药物股份公司，
类型：
国别省市：