本发明专利技术提供的一种新型猪瘟病毒E2重组杆状病毒灭活疫苗，通过猪瘟病毒E2基因的合成、转移载体的构建、转移载体与线性杆状病毒的重组、重组杆状病毒的分子生物学和免疫学鉴定、猪瘟病毒E2蛋白的表达、猪瘟病毒E2重组杆状病毒的灭活、猪瘟病毒E2蛋白与佐剂563VG乳化制成疫苗、猪瘟病毒E2重组杆状病毒灭活疫苗的安全性检验、猪瘟病毒E2重组杆状病毒灭活疫苗的效力检验等系列的研究证明，猪瘟病毒E2重组杆状病毒灭活疫苗做为一种新型的亚单位疫苗，不仅具有良好的安全性，而且免疫效力与猪瘟兔化弱毒疫苗效力相当。
【技术实现步骤摘要】
一种新型猪瘟病毒E2重组杆状病毒灭活疫苗及其制备方法
本专利技术涉及猪瘟病毒E2重组杆状病毒的构建、猪瘟病毒E2蛋白的表达和猪瘟病毒E2重组杆状病毒灭活疫苗的效力检验，新型疫苗具有与活疫苗相当的免疫效力。
技术介绍
目前常规的猪瘟活疫苗有两种生产方法，一是将种毒接种于健康家兔在其体内繁殖，然后采集家兔的脾脏和淋巴结研磨后冻干而成；二是将种毒接种原代细胞或传代细胞，收取上清冻干而制成。第一种生产方法需用大量的家兔来采集抗原，此外，由于受家兔个体差异的影响，导致抗原质量层次不齐，最终影响疫苗的效果；第二种生产方法在生产过程中需用牛源血清，牛源血清不仅在制品中引入异源动物蛋白而且有可能污染牛病毒性腹泻，影响了疫苗的安全性，此外，活疫苗免疫仔猪后受母源抗体的影响，导致免疫效果不佳或免疫失败。文献检索披露:生产猪瘟活疫苗的S0P，用家兔生产猪瘟活疫苗的方法，取健康家兔通过耳源静脉将种毒接种于家兔体内，根据体温反应判定家兔脾脏和淋巴结是否合格，体温反应分为定型热反应、轻热反应、可疑反应和无反应；无菌采集体温反应为定型热反应和轻热反应家兔的脾脏和淋巴结，低温研磨、分装和冻干，检验合格，即为猪瘟兔化弱毒疫苗(脾淋源)；用原代细胞或传代细胞生产猪瘟活疫苗的方法，种毒接种于生长良好的原代细胞或传代细胞，接种，收获上清，分装和冻干后，检验合格后，即为猪痕兔化弱毒疫苗(细胞源)；因此国内有很多机构用重组杆状病毒表达猪瘟病毒E2基因，基本终止于E2蛋白的表达，未进行过一系列的靶动物(猪)效力验证。本专利技术构思将猪瘟病毒的E2基因克隆到转移载体上与线性的杆状病毒重组，将重组后的杆状病毒进行分子生物学和免疫学的鉴定，正确无误后在昆虫细胞上表达猪瘟病毒E2蛋白，经灭活与佐剂乳化后制成疫苗，并与目前市场上销售的猪瘟兔化弱疫苗(传代细胞源)进行效力比较，结果表明:猪瘟病毒E2重组杆状病毒和猪瘟兔化弱疫苗(传代细胞源)免疫猪后，用猪瘟石门系血毒进行攻毒，保护效力相当，达到了设计要求。
技术实现思路
本专利技术的目的在于:研制的新型猪瘟病毒E2重组杆状病毒灭活疫苗，不仅具有与猪瘟兔化弱毒疫苗具有相当的免疫效力，而且提高疫苗的安全性，避免因兔体差异照成疫苗质量层次不齐或因引入源蛋白和病毒给疫苗制品带来的风险，同时为今后猪瘟病毒的净化提供物质保障。本专利技术的目的是这样实现的:一种新型猪瘟病毒E2重组杆状病毒灭活疫苗，包括猪瘟病毒E2基因的合成、转移载体的构建、转移载体与线性杆状病毒的重组、重组杆状病毒的分子生物学和免疫学鉴定、猪瘟病毒E2蛋白的表达、猪瘟病毒E2重组杆状病毒的灭活、猪瘟病毒E2蛋白与佐剂563VG乳化制成疫苗、猪瘟病毒E2重组杆状病毒灭活疫苗的安全性检验、猪瘟病毒E2重组杆状病毒灭活疫苗的效力检验；分步实施如下:I)猪瘟病毒E2基因优化及合成:在参考国内外经典毒株和流行毒株的E2基因基础上，按昆虫细胞内密码子偏嗜性进行猪瘟病毒E2基因的优化，将优化好的序列(命名为CSFV-HC-E2)交与基因公司合成；2)转移载体的构建:通过TOPOli克隆将合成的猪瘟病毒E2基因克隆到pENTR/D-T0P0K载体上，构建出含有猪瘟病毒E2基因的pENTR-E2转移载体；3)转移载体与线性杆状病毒的重组:应用Invitrogen公司的BaculoDirect?Baculovirus Expression System试剂盒将pENTR_E2转移载体与线性的杆状病毒进行重组反应，将猪瘟病毒的E2基因重组于杆状病毒；4)重组杆状病毒的分子生物学和免疫学鉴定:将上述重组后的杆状病毒在Sf-9细胞上增殖后取两份样本，一份提取病毒基因，用猪瘟病毒E2基因的引物扩增E2基因；另一份通过SDS-PAGE和Western-blot方法确定E2蛋白表达和免疫原性，鉴定无误后进行E2蛋白的表达。5)猪瘟病毒E2蛋白的表达:将鉴定无误的重组杆状病毒以MOI为I接种于Sf_9细胞，培养4d，去除细胞碎片，上清即为猪瘟病毒E2蛋白(抗原)；6)猪瘟病毒E2重组杆状病毒的灭活JfBEI加入抗原中，终浓度为lmmol/L，置37°C灭活48h，即可将重组病毒彻底灭活；7)猪瘟病毒E2蛋白与563VG乳化制成疫苗:将定猪瘟病毒E2蛋白与563VG按质量比1:1混合，采用均质机，在12000rpm条件下,将抗原液佐剂均质，时间为IOmin,即制成猪瘟病毒E2重组杆状病毒灭活疫苗；本专利技术获取猪瘟病毒E2重组杆状病毒灭活疫苗的安全性检验:将猪瘟病毒E2重组杆状病毒灭活疫苗2倍剂量(4ml/头)免疫猪后，未见局部与全身不良反应。本专利技术通过猪瘟病毒E2基因的合成、转移载体的构建、转移载体与线性杆状病毒的重组、重组杆状病毒的分子生物学和免疫学鉴定、猪瘟病毒E2蛋白的表达、猪瘟病毒E2重组杆状病毒的灭活、猪瘟病毒E2蛋白与佐剂563VG乳化制成疫苗、猪瘟病毒E2重组杆状病毒灭活疫苗的安全性检验、猪瘟病毒E2重组杆状病毒灭活疫苗的效力检验等一系列的研究证明，猪瘟病毒E2重组杆状病毒灭活疫苗做为一种新型的亚单位疫苗，不仅具有良好的安全性，而且免疫效力与猪瘟兔化弱毒疫苗效力相当，此外，本疫苗免疫动物只产生针对E2蛋白产的抗体，可通过Erns抗体诊断试剂盒区分免疫疫苗产生的抗体和感染野毒产生的抗体，在应用中具有广阔的前景，彰显技术进步。 本专利技术获取猪瘟病毒E2重组杆状病毒灭活疫苗的效力检验:取猪瘟抗体为阴性的健康猪25头，其中15头免疫3批猪瘟病毒E2重组杆状病毒，5头免疫猪瘟兔化弱毒(传代细胞源)，另5头为对照组，免疫组每头耳后颈部肌肉注射猪瘟病毒E2重组杆状病毒灭活疫苗2ml，一免后21d以相同剂量和方式进行二免，二免后14d，连同对照猪5头，各注射猪瘟病毒石门系血毒1.0ml/头(含IO5 tlMLD)，观察16d，对照猪应全部发病，且至少死亡3头，免疫猪应全部健活或稍有体温反应，但无猪瘟临床症状，证明了灭活疫苗的具有与活疫苗相当的免疫效力，同时为今后猪瘟病毒的净化提供物质保障，【附图说明】下面将结合附图对专利技术作进一步说明。附图1为猪瘟病毒E2重组杆状病毒E2基因的PCR鉴定图；如图所示:I:阴性对照;2:阳性对照;3:DNA Marker; 4:猪瘟病毒E2重组杆状病毒；证明了构建的重组杆状病毒含有猪瘟病毒E2基因。附图2为猪瘟病毒E2重组杆状病毒免疫学鉴定Western-blot图；如图所示:1、2、3、4、5均为猪瘟病毒E2重组杆状病毒表达的E2蛋白；证明了构建的猪瘟病毒E2重组杆状病毒接种Sf-9细胞后能够正确有效表达猪瘟E2蛋白。【具体实施方式】下面将结合实施例对专利技术作进一步说明。1、猪瘟病毒E2基因优化及合成从Genebank下载了已发表的猪瘟病毒E2序列作参考，在C株E2基因基础上进行了优化，将优化后的E2基因与各亚群的参考株进行比对，结果显示优化后的E2基因确定为1.1群，将优化后的序列(CSFV-HC-E2)交与基因合成公司合成。鉴定猪瘟病毒E2基因的引物 BacE2Fl:5’ -CACCATGGCATTTCTCATCTGCTTG GTA-3’，BacE2_Rl: 5’ -AAATTCTGCGAAGTAATCTGA GTG-3’。2、转移载体的构建试验方法参考I本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种新型猪瘟病毒E2重组杆状病毒灭活疫苗及其制备方法，其特征在于：分步实施；步骤1猪瘟病毒E2基因优化及合成：昆虫细胞内密码子偏嗜性进行猪瘟病毒E2基因的优化，将优化好的序列交与基因合成公司合成；步骤2转移载体的构建：通过TOPO®克隆将合成的猪瘟病毒E2基因克隆到pENTR/D‑TOPO® 载体上，构建出含有猪瘟病毒E2基因的pENTR‑E2转移载体；步骤3转移载体与线性杆状病毒的重组：应用Invitrogen公司的BaculoDirectTM Baculovirus Expression System试剂盒将pENTR‑E2转移载体与线性的杆状病毒进行重组反应，将猪瘟病毒的E2基因重组于杆状病毒；步骤4重组杆状病毒的分子生物学和免疫学鉴定：将上述重组后的杆状病毒在Sf‑9细胞上增殖后取样，一份提取病毒基因，用猪瘟病毒E2基因的引物扩增E2基因；另一份通过SDS‑PAGE和 Western‑blot方法确定E2蛋白表达和免疫原性，进行E2蛋白的表达；步骤5猪瘟病毒E2蛋白的表达：将重组杆状病毒以MOI为1接种于Sf‑9细胞，培养4d，去细胞碎片，上清即为猪瘟病毒E2蛋白；步骤6猪瘟病毒E2重组杆状病毒的灭活：将BEI加入抗原中，终浓度为1mmol/L，置37℃灭活48h，即使重组病毒灭活;步骤7猪瘟病毒E2蛋白与563VG乳化制成疫苗：将猪瘟病毒E2蛋白与563VG按质量比1:1混合，采用均质机，在12000rpm条件下，将抗原液佐剂均质，时间为10min，即制成猪瘟病毒E2重组杆状病毒灭活疫苗。...
【技术特征摘要】
1.一种新型猪瘟病毒E2重组杆状病毒灭活疫苗及其制备方法，其特征在于:分步实施； 步骤1猪瘟病毒E2基因优化及合成:昆虫细胞内密码子偏嗜性进行猪瘟病毒E2基因的优化，将优化好的序列交与基因合成公司合成； 步骤2转移载体的构建:通过TOPO?克隆将合成的猪瘟病毒E2基因克隆到pENTR/D-T0P0?载体上，构建出含有猪瘟病毒E2基因的pENTR-E2转移载体； 步骤3转移载体与线性杆状病毒的重组:应用Invitrogen公司的BaculoDirect?Baculovirus Expression System试剂盒将pENTR_E2转移载体与线性的杆状病毒进行重组反应，将猪瘟病毒的E2基因重组于杆状病毒； 步骤4重组杆状病毒的分子生物学和免疫学鉴定:将上述重组后的杆状病毒在Sf-9细胞上增殖后取样，一份提取病毒基因，用猪瘟病毒E2基因的引物扩增E2基因；另一份通过SDS-PA...
【专利技术属性】
技术研发人员：李俊辉，刘宏，王尊宝，李延涛，贺笋，
申请(专利权)人：新疆天康畜牧生物技术股份有限公司，
类型：发明
国别省市：新疆;65
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