表达GM-CSF重组PRRSV弱毒疫苗株及其制备方法和应用技术

本发明专利技术公开了一种猪繁殖与呼吸综合征病毒弱毒疫苗株，该疫苗株包含猪繁殖与呼吸综合征病毒弱毒疫苗株HuN4-F112的基因组核酸，在该HuN4-F112基因组的ORF1b和ORF2a之间插入有GM-CSF序列，该GM-CSF序列为SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列。本发明专利技术还公开了一种上述猪繁殖与呼吸综合征病毒弱毒疫苗株的制备方法和应用。本发明专利技术的猪繁殖与呼吸综合征病毒弱毒疫苗株，不仅能够稳定表达GM-CSF，具有遗传稳定性，而且该重组表达GM-CSF的PRRSV弱毒疫苗株，可促使DC细胞活化和成熟，进而增强APC的抗原呈递能力，明显提高PRRSV弱毒疫苗的细胞免疫水平。

【技术实现步骤摘要】
表达GM-CSF重组PRRSV弱毒疫苗株及其制备方法和应用
本专利技术涉及生物工程
，尤其涉及一种表达GM-CSF重组猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）弱毒疫苗株及其制备方法和应用。
技术介绍
目前，猪繁殖与呼吸综合征(PRRS)被认为是当今养猪业最严重的传染病，已经对我国乃至世界养猪业造成了巨大的经济损失。猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）感染后宿主产生中和抗体和细胞免疫应答比较迟缓，造成了一定程度的免疫抑制。PRRSV在宿主体内感染的靶细胞为肺泡巨噬细胞，在体外PRRSV也感染其他的免疫相关细胞，如单核源树突状细胞、类浆细胞源树突状细胞等。树突状细胞（DC）是专业的抗原呈递细胞(APC)，在先天性免疫和获得性免疫中发挥了重要的桥梁作用。有研究表明PRRSV感染DCs时能够干扰DCs的表面分子的表达，从而抑制DCs发挥抗原呈递的功能。亦或是通过感染单核源DCs阻碍IFN-alpha的翻译或其RNA的转运和加工，使得I型干扰素表达量下降。目前针对PRRSV病毒感染最有效地预防和控制措施是疫苗接种，而现阶段临床应用针对PRRSV的疫苗主要有两大类，即灭活疫苗和弱毒疫苗。其中对于灭活疫苗其免疫效果尚存争议，有人认为PRRSV灭活疫苗安全性好，但是由于PRRSV存在抗体依赖增强作用，导致灭活疫苗在临床上的免疫效果低于期望值，也有人认为灭活疫苗能够针对同源PRRS毒株产生良好的免疫保护，但是由于PRRSV易发生变异，导致灭活疫苗对于PRRS的异源毒株防控效果较差。PRRSV弱毒疫苗在该病防控上发挥了重要作用，PRRSV弱毒疫苗不仅能提供高水平的体液免疫，而且还能提供良好的细胞免疫，具有免疫效率高，免疫持续期长等优势，相对于灭活疫苗而言弱毒疫苗在临床上应用更为普遍。但现有的PRRSV弱毒疫苗的使用依然存在诱导产生中和抗体和细胞免疫应答较为迟缓或者水平较低，导致对PRRSV感染早期有效控制做出快速免疫应答的效果不佳，从而影响了PRRS疫苗的免疫效果。粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)是一种具有多项潜能的造血生长因子，属于一种细胞因子。
技术实现思路
本专利技术要解决现有PRRSV弱毒疫苗普遍存在诱导产生中和抗体和细胞免疫应答较为迟缓或者水平较低、导致免疫效果不佳的技术问题，提供一种PRRSV弱毒疫苗株，该弱毒疫苗株能稳定表达猪源粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)，显著提高了PRRSV弱毒疫苗的免疫效果。此外，还需要提供一种上述PRRSV弱毒疫苗株的制备方法和应用。为了解决上述技术问题，本专利技术通过如下技术方案实现:在本专利技术的一个方面，提供了一种猪繁殖与呼吸综合征病毒弱毒疫苗株，包含猪繁殖与呼吸综合征病毒弱毒疫苗株HuN4-F112的基因组核酸，在该HuN4-F112基因组的ORF1b和ORF2a之间插入有GM-CSF序列，该GM-CSF序列为SEQIDNO.1所示的核苷酸序列。优选的，所述插入的GM-CSF序列还连接有转录调控序列；更优选的，所述插入的GM-CSF序列3’端还连接有猪繁殖与呼吸综合征病毒ORF6转录调控序列(TRS6)，该转录调控序列(TRS6)为SEQIDNO.2所示的核苷酸序列。在本专利技术的另一方面，提供了一种核酸分子，包含连接有转录调控序列的GM-CSF序列，该GM-CSF序列为SEQIDNO.1所示的核苷酸序列。优选的，所述转录调控序列与GM-CSF序列3’端相连接，该转录调控序列为SEQIDNO.2所示的核苷酸序列。在本专利技术的另一方面，还提供了一种核酸分子，包含猪繁殖与呼吸综合征病毒弱毒疫苗株HuN4-F112的基因组多核苷酸序列，在该HuN4-F112基因组序列的ORF1b和ORF2a之间插入连接有转录调控序列的GM-CSF序列。在本专利技术的另一方面，还提供了一种包含上述核酸分子的重组载体。在本专利技术的另一方面，还提供了一种猪繁殖与呼吸综合征病毒弱毒疫苗株的制备方法，包括以下步骤：构建包含一种核酸分子的重组载体，该核酸分子包含猪繁殖与呼吸综合征病毒弱毒疫苗株HuN4-F112的基因组多核苷酸序列，在该HuN4-F112基因组序列的ORF1b和ORF2a之间插入连接有转录调控序列的GM-CSF序列；将所述重组载体线性化后，体外转录成病毒RNA，再将该病毒RNA转染细胞；将转染的细胞进一步接种于细胞上培养，进行病毒拯救，获得重组表达GM-CSF的猪繁殖与呼吸综合征病毒弱毒疫苗株。在本专利技术的另一方面，还提供了一种上述猪繁殖与呼吸综合征病毒弱毒疫苗株在制备预防或治疗高致病性猪繁殖与呼吸综合征的疫苗中的应用。在本专利技术的另一方面，还提供了一种区分上述猪繁殖与呼吸综合征病毒弱毒疫苗株与野毒株感染的检测试剂盒，包含：针对SEQIDNO.1所示插入基因序列设计的引物对。本专利技术猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）弱毒疫苗株，不仅能够稳定表达GM-CSF，具有遗传稳定性，而且重组表达GM-CSF的PRRSV弱毒疫苗株，可促使DC细胞活化、成熟，进而增强APC的抗原呈递能力，明显提高PRRSV弱毒疫苗的细胞免疫水平。因此，本专利技术的PRRSV弱毒疫苗株有望成为今后新型疫苗开发和临床应用的候选弱毒疫苗株。附图说明下面结合附图和具体实施方式对本专利技术作进一步详细的说明。图1是本专利技术实施例2拯救的病毒感染Marc-145细胞后的细胞病变图；图2是本专利技术实施例2重组病毒rHN4-GM-CSF的RT-PCR鉴定结果图；图3是本专利技术实施例2重组病毒rHN4-GM-CSF的MluΙ酶切鉴定结果图；图4是本专利技术实施例2重组病毒的间接免疫荧光鉴定结果图；图5是本专利技术实施例2重组病毒的Westernblotting鉴定结果图；图6是本专利技术实施例3重组病毒的生长曲线图；图7是本专利技术实施例3重组病毒的蚀斑形态观察图；图8是本专利技术实施例3的第5代、10代、15代和20代重组病毒的RT-PCR检测结果图；图9是本专利技术实施例3重组病毒rHN4-GM-CSF遗传稳定性分析图；图10是本专利技术实施例3第20代重组病毒表达GM-CSF的IFA鉴定结果图；图11是本专利技术实施例4重组病毒rHN4-GM-CSF的功能分析柱状图。具体实施方式下列实施例中，未注明具体条件的实验方法，通常按常规条件，如《精编分子生物学实验指南》(F.M.奥斯伯,R.E.金斯顿,J.G.塞德曼等主编，马学军,舒跃龙的译.北京：科学出版社，2004)中所述的方法进行。为了能进一步提高PRRSV弱毒疫苗的免疫效果，本专利技术通过分子生物学手段对PRRSV商品化弱毒疫苗株HuN-F112的基因组进行设计和改造。PRRSV弱毒疫苗株HuN-F112是本实验室通过将高致病性PRRSV强毒HuN4株体外传代致弱获得的减毒活疫苗株，之前的大量临床实验证实HuN4-F112弱毒疫苗株具有很好的免疫保护力（专利号为200810097546.8的中国专利技术专利）。本专利技术在PRRSV弱毒疫苗HuN-F112株感染性分子克隆（专利号为201010559005.X的中国专利技术专利）的基础上，通过融合PCR的方法在ORF1b和ORF2a之间插入猪源GM-CSF（粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子）和PRRSVORF6转录调控序列(TRS6)，获得了重组表达载体pHuN4-F112-GM-CSF，将本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种猪繁殖与呼吸综合征病毒弱毒疫苗株，其特征在于，包含猪繁殖与呼吸综合征病毒弱毒疫苗株HuN4‑F112的基因组核酸，在该HuN4‑F112基因组的ORF1b和ORF2a之间插入有GM‑CSF序列，该GM‑CSF序列为SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列。

【技术特征摘要】
1.一种猪繁殖与呼吸综合征病毒弱毒疫苗株，其特征在于，包含猪繁殖与呼吸综合征病毒弱毒疫苗株HuN4-F112的基因组核酸，在该HuN4-F112基因组的ORF1b和ORF2a之间插入有GM-CSF序列，该GM-CSF序列为SEQIDNO.1所示的核苷酸序列；所述插入的GM-CSF序列3’端还连接有猪繁殖与呼吸综合征病毒ORF6转录调控序列，该转录调控序列为SEQ...

【专利技术属性】
技术研发人员：童光志，虞凌雪，周艳君，姜一峰，童武，于海，李国新，高飞，
申请(专利权)人：中国农业科学院上海兽医研究所，
类型：发明
国别省市：上海;31