作为人用疫苗的重组分枝杆菌制造技术

本发明专利技术涉及在人对象中提供保护性免疫、特别是针对结核的保护性免疫的重组疫苗。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】作为人用疫苗的重组分枝杆菌本专利技术涉及在人对象中提供保护性免疫、特别是针对结核的保护性免疫的新型重组疫苗。1993年，世界卫生组织(WHO)已宣布结核(TB)全球性紧急状况。全世界约20亿人i’2感染有结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis) -TB的病原微生物。这些人均存在发展为该疾病的临床症状的风险。在大多数个体中，结核分枝杆菌感染最初被宿主防御所耐受，感染仍处于潜伏期。然而，潜伏的TB感染具有在任何时候发展为活动的TB病的潜能，而带有活性的TB的个体成为新的感染源。在WHO报告(2009)中，报道2007年新病例的数量为930万S并且正稳步增长。每年，约180万人死于该疾病。因此，TB继续成为全球范围内感染病致死的主要起因。卡介苗(Bacillus Calmette-Guerin,BCG)，减毒的牛分枝杆菌菌株，自1921年已用作TB疫苗。迄今，约40亿剂量已经被施用。3然而，以BCG接种疫苗对于阻止TB散布不够有效。BCG可以防止、至少减轻儿童系统性TB的严重症状，特别是脑膜炎。BCG不防止该疾病的肺感染形式。4然而，这对于中断该疾病的传播可能是必要的。仅存在几种抗生素治疗。它们越来越多地失败，因为越来越多的患者被多药耐药性的TB菌株所感染。15使这种状况更严重的是，新的高度致病性菌株，如结核分枝杆菌Bei jing/W,正在传播。6本专利技术的一个目的是开发抗TB的安全、良好耐受而有效的疫苗，特别对于流行病区的居民和非流行病区危险人群。该疫苗将替代当前所用的BCG疫苗。新的疫苗应当至少与现有菌株一样有效，并应当比BCG更为安全。5’7结核分枝杆菌和BCG由宿主巨噬细胞吞噬。细菌病原体在吞噬体内的定位使得细菌抗原通过主要组织相容性复合物(MHC) II途径运输。这导致优选刺激⑶4T细胞。然而，已表明MHC I限制性CD8毒性T细胞在针对结核分枝杆菌的免疫中至关重要。8，9不同于结核分枝杆菌，BCG仅对⑶8细胞毒性T细胞有微弱刺激。2，3〃°因此，产生表达吞噬溶酶体逃逸结构域的重组BCG菌株，以将分枝杆菌病原体导向MHC I途径。2，7该菌株分泌单核细胞增多性李斯特氏菌(L.monocytogenes)的李斯特菌溶胞素(Hly)。7’n这使得该菌株可以通过穿透吞噬体膜的方式逃逸受感染宿主细胞的吞噬体。失活脲酶C基因对于在吞噬体中保证最适Hly活性的酸性pH值是必需的。穿孔促使抗原转位到胞浆中，并且有利于通过增加的细胞凋亡得到交叉敏化。7’9这个过程能非常有效的模拟结核分枝杆菌对于免疫系统的诱导。这个作用模式预期将会发展出针对TB的有效并很好耐受的疫苗。这些概念已经在W099/101496和W02004/094469中描述过，其内容通过引用并入本文。在这个研究中，重组脲酶缺陷型BCG疫苗首次被应用与人类对象。本研究评估了这种疫苗的安全性，局部 与系统耐受性以及免疫原性。与商用的BCG疫苗相比，本研究使用了剂量递增的序贯设计。在德国，80个对象按照他们以前BCG的免疫记录分层被随机分为4组,每组20个对象。除了标准安全性监控之外，还进行加强型安全性监控，包括实验室参数、身体安全评估和详细的ECG分析。本专利技术的一个主题是应用于人的包含重组分枝杆菌作为活性成分的疫苗，所述重组分枝杆菌是脲酶缺陷型的并且包含编码融合多肽的重组核酸分子，所述融合多肽包含Ca)结核分枝杆菌抗原或其免疫原性片段，和(b)吞噬溶酶体逃逸结构域。本专利技术的另一主题是一种对人类对象接种疫苗的方法，包括施用药学上有效剂量的重组分枝杆菌，所述重组分枝杆菌是是脲酶缺陷型的并且包含编码融合多肽的重组核酸分子，所述融合多肽包含(a)结核分枝杆菌抗原或其免疫原性片段，和(b)吞噬溶酶体逃逸结构域。在一个特别优选的实施方案中，ureC序列是失活的(AUrec)，比如通过构建包含被选择性标记基因打断的ureC基因的自杀载体，用该载体转染目标细胞，并筛选具有脲酶阴性表型的选择性基因阳性细胞。所述细胞优选为牛分枝杆菌(M.bovis)细胞、结核分枝杆菌细胞(尤其是减毒的结核分枝杆菌细胞)或其他分枝杆菌，比如田鼠分枝杆菌(M.microti)、耻垢分枝杆菌(M.smegmatis)、卡内蒂分枝杆菌(M.canetti)、海洋分枝杆菌(M.marinum)或偶发分枝杆菌(M.fortuitum)。更优 选的,所述细胞是重组牛分枝杆菌OCG)细胞,尤其是来自丹麦株布拉格亚型(Danish subtype Prague)的重组牛分枝杆菌细胞13。最优选的，所述细胞是重组BCG丹麦株布拉格亚型，其表征为rBCG AUrec::Hly+::Hyg+(VPM1002)。本专利技术的分枝杆菌细胞包含重组核酸分子，如SEQ ID N0.1的核酸分子。该核酸分子包含信号肽编码序列(核苷酸1-120),编码免疫原性结构域的序列(核苷酸121-153),肽接头编码序列(核苷酸154-210)，编码吞噬溶酶体结构域的序列(核苷酸211-1722)，另一肽接头编码序列(核苷酸1723-1800)和编码随机肽的序列(核苷酸1801-1870)。相应的氣基酸序列不于SEQ ID N0.2。能够引发免疫反应的结构域选自牛分枝杆菌或结核分枝杆菌来源的免疫原性肽或多肽，或者长度为至少6个氨基酸、优选至少8个氨基酸的其免疫原性片段。合适抗原的具体实例是从结核分枝杆菌来源的Ag85B(p30) (Harth等人，1996)，从牛分枝杆菌BCG来源的Ag85B( a -抗原)(Matsuo等人，1988),从结核分枝杆菌来源的Ag85A(Huygen等人，1996),以及从结核分枝杆菌来源的ESAT-6 (Sorensen等人，1996, Harboe等人，1996和Andersen等人，1995)。更优选,免疫原性结构域衍生于抗原Ag85B。最优选,免疫原性结构域包含在SEQ ID N0.2中从41位到51位氨基酸的序列。重组DNA分子进一步包含吞噬溶酶体逃逸结构域，即提供融合多肽从吞噬溶酶体中逃逸到哺乳动物细胞胞浆中的多肽结构域。优选的是，该吞噬溶酶体逃逸结构域是在US5, 733，151描述过的李斯特氏菌的吞噬溶酶体逃逸结构域。更优选的是，吞噬溶酶体逃逸结构域是从单核细胞增多性李斯特氏菌的李斯特菌溶胞素基因(Hly)衍生而来的。最优选的是，该吞噬溶酶体逃逸结构域由选自下列的核酸分子编码:(a)包含如SEQ ID N0.1中所示的211-1722位核苷酸的核苷酸序列，(b)编码与在(a)序列相同氨基酸序列的核苷酸序列，和(c)在严格条件下和(a)或(b)序列发生杂交的核苷酸序列。除了在SEQ ID N0.1中描述的核苷酸序列之外，本专利技术也包括与之发生杂交的核酸序列。在本专利技术中，如 Sambrook 等人(Molecular Cloning.A laboratory manual, ColdSpring Harbor Laboratory Press (1989), 1.101-1.104)中所定义使用术语“杂交”。在本专利技术中，术语“杂交”在如下情况使用:在55° C、优选62° C、更优选68° C以IX SSC和0.1%SDS洗涤I小时之后，特别是在55° C本文档来自技高网...

【技术保护点】
人用疫苗，其包含作为活性成分的重组分枝杆菌，所述重组分枝杆菌为脲酶缺陷型并包含编码融合多肽的重组核酸分子，所述融合多肽包含（a）分枝杆菌抗原或其免疫原性片段和（b）吞噬溶酶体逃逸结构域。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2010.09.20 US 61/384,3751.人用疫苗，其包含作为活性成分的重组分枝杆菌，所述重组分枝杆菌为脲酶缺陷型并包含编码融合多肽的重组核酸分子，所述融合多肽包含(a)分枝杆菌抗原或其免疫原性片段和(b)吞噬溶酶体逃逸结构域。2.权利要求1的疫苗，其中所述重组 分枝杆菌细胞为重组牛分枝杆菌(BCG)细胞，特别是来自丹麦株布拉格亚型的重组牛分枝杆菌细胞。3.权利要求1或2的疫苗，其中所述分枝杆菌抗原是Ag85B。4.权利要求1-3任一项的疫苗，其中所述重组分枝杆菌细胞携带抗生素抗性基因，例如潮霉素抗性基因。5.权利要求1-3任一项的疫苗，其中所述重组分枝杆菌细胞不携带抗生素抗性基因。6.权利要求1-3 任一项的疫苗，其为 rBCG AUrec::Hly+::Hyg+ (VPM1002)。...

【专利技术属性】
技术研发人员：L·格罗德，
申请(专利权)人：疫苗项目管理有限公司，
类型：发明
国别省市：德国;DE